α晶狀體蛋白對大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用研究.pdf

1、視神經(jīng)損傷后如何修復,提高其臨床治療效果,一直是神經(jīng)科學研究的熱點。近年來,外源性α晶狀體蛋白在視神經(jīng)損傷后修復中發(fā)揮的作用日益受到人們關注。已有的研究表明,α晶狀體蛋白對RGCs的存活和突起生長有顯著促進作用,是重要的晶狀體源性“神經(jīng)保護物質”。同時,α晶狀體蛋白還可以通過抑制視網(wǎng)膜小膠質細胞的增殖、遷移及活化,降低細胞中TNF-α、iNOS蛋白的濃度及mRNA的表達,減輕其對RGCs的損害。既往文獻證實,當細胞受到應激刺激和其它損傷

2、因素作用時,可啟動胞內(nèi)HSPs基因,促使HSPs合成,從而對細胞有一定的保護作用。因此,α晶狀體蛋白作為熱休克蛋白家族成員,是否參與了視神經(jīng)損傷后的內(nèi)源性保護?視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞是否能表達內(nèi)源性α晶狀體蛋白?倘若視神經(jīng)損傷后,能使視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞高表達α晶狀體蛋白,是否具有更為理想的神經(jīng)保護作用?上述問題均未見文獻報道。由此,進一步探討內(nèi)源性α晶狀體蛋白在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中的變化和作用,可能為臨床治療視神經(jīng)損傷提供新的途徑。
　　

3、 [目的]
　　 通過建立大鼠視神經(jīng)鉗夾傷模型,進一步明確外源性α晶狀體蛋白對神經(jīng)損傷后軸突生長的定量變化;通過離體和在體研究,探討視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中內(nèi)源性α晶狀體蛋白的表達;在此基礎上,采用腺病毒介導的基因轉染技術,分析α晶狀體蛋白高表達對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的影響。從而闡明α晶狀體蛋白在視神經(jīng)損傷所誘導的神經(jīng)節(jié)細胞凋亡中的作用,并為基因治療或合成新型的短肽藥物治療視網(wǎng)膜視神經(jīng)損傷奠定實驗基礎。
　　 [方法]

4、　　 1、以成年Long Evans大鼠為研究對象,建立視神經(jīng)鉗夾損傷模型,玻璃體腔單次注射10-4g/L外源性α晶狀體蛋白。通過視神經(jīng)冠狀切片和神經(jīng)軸突鍍銀染色方法,利用計算機圖象分析系統(tǒng),分別于損傷后1、2、4周,定量分析和比較視神經(jīng)損傷遠端0.5mm、2mm、5mm處的視神經(jīng)軸突數(shù)量。
　　 2、原代培養(yǎng)新生大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞,通過免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡,觀察培養(yǎng)的細胞中內(nèi)源性α晶狀體蛋白的表達,并采用RT-P

5、CR方法檢測細胞中內(nèi)源性α晶狀體蛋白mRNA的表達規(guī)律。同時,利用成年大鼠視神經(jīng)鉗夾損傷模型和全視網(wǎng)膜鋪片的免疫組化方法,觀察視神經(jīng)損傷對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中內(nèi)源性α晶狀體蛋白表達的影響。
　　 3、利用同源重組原理,將α晶狀體蛋白cDNA克隆入腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV,構建攜帶α晶狀體蛋白編碼基因的重組腺病毒表達載體。脂質體法轉染293細胞,獲得重組腺病毒質粒Ad-Crystallina。
　　 4、將重組

6、腺病毒Ad-crystallina感染培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞,并給予缺氧刺激,通過RT-PCR和werstern blot檢測細胞中α晶狀體蛋白、caspase-3、bcl-2的表達水平,探討α晶狀體蛋白高表達對缺氧后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的影響。
　　 [結果]
　　 1、視神經(jīng)損傷后,神經(jīng)軸突數(shù)量的改變主要發(fā)生在損傷后2周內(nèi),并且離損傷點越近,其神經(jīng)軸突數(shù)量減少越明顯。通過單次玻璃體腔給藥途徑,外源性α晶狀體蛋白可

7、以顯著減少大鼠視神經(jīng)損傷后神經(jīng)軸突數(shù)量的丟失。但在損傷后4周,α晶狀體蛋白的神經(jīng)保護作用明顯減弱。
　　 2、用新生大鼠進行視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞原代培養(yǎng),培養(yǎng)的RGCs可表達內(nèi)源性α晶狀體蛋白,陽性染色位于RGCs胞膜和軸突。在原代培養(yǎng)第3～5d的RGCs中,內(nèi)源性α晶狀體蛋白mRNA的表達顯著增強(P＜0.05)。
　　 3、正常成年大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞內(nèi)源性α晶狀體蛋白表達為陰性。而視神經(jīng)鉗夾傷后的成年大鼠視網(wǎng)膜中可見內(nèi)

8、源性α晶狀體蛋白陽性表達。
　　 4、采用RT-PCR方法成功擴增crystallina目的片段,KpnⅠ和HindⅢ雙酶切重組質粒pAdTrack-CMV-crystallina,蛋白電泳及測序結果顯示質粒構建成功,可觀察到載體片段和目的基因片段。質粒與腺病毒骨架質粒pAdeasy-1同源重組成功后轉染293細胞,進行5次傳代純化后獲得重組腺病毒Ad-crystallina。所獲得的腺病毒滴度為1.143×109 ifu/mL

9、。
　　 5、Ad-crystallina可在培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中高表達。與單純?nèi)毖踅M相比,缺氧刺激后Ad-crystallina轉染組細胞中α晶狀體蛋白表達量約為單純?nèi)毖踅M細胞的1.8倍,統(tǒng)計學差異顯著(P＜0.05)。
　　 6、給予細胞缺氧刺激后,與單純?nèi)毖踅M相比,Ad-crystallina轉染組RGCs中caspase-3的蛋白表達水平下降59％,統(tǒng)計學差異非常顯著(P＜0.01)。
　　 [結

10、論]
　　 1、α晶狀體蛋白在視神經(jīng)損傷后修復中發(fā)揮重要作用。通過玻璃體腔注射途徑單次給藥,可明顯減少受損視神經(jīng)軸突數(shù)量的丟失。
　　 2、在離體條件下,原代培養(yǎng)的新生大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞有內(nèi)源性α晶狀體蛋白表達。在動物實驗中,視神經(jīng)損傷可以誘發(fā)成年大鼠視網(wǎng)膜表達內(nèi)源性α晶狀體蛋白,提示α晶狀體蛋白可能參與了視網(wǎng)膜內(nèi)源性神經(jīng)保護作用。
　　 3、成功構建了高表達α晶狀體蛋白的重組腺病毒質粒。
　　 4、腺