非小細胞肺癌中miR-335的表達及對生長、侵襲和凋亡的影響.pdf

1、背景和目的:
　　肺癌是世界上致死率最高的癌癥，可分為小細胞肺癌（SCLCs）和非小細胞肺癌（NSCLCs）兩類，其中非小細胞肺癌占肺癌總數(shù)的80％。肺癌預(yù)后極差，一般來說5年生存率大約為15%。基因靶向治療已經(jīng)成為新的肺癌治療方向，了解肺癌的發(fā)生、發(fā)展機制，發(fā)現(xiàn)和認識新的治療靶點以用于肺癌的診斷和治療，對我們早日攻克腫瘤有的重要意義。
　　微小RNA(microRNA，miRNA)是在真核細胞中廣泛存在非編碼單鏈RNA，長

2、度大約22個核苷酸，miRNA能夠通過和靶基因mRNA的3’ UTR區(qū)堿基配對從而參與基因轉(zhuǎn)錄后的水平調(diào)控，對生物體的生長、分化、增值、凋亡等發(fā)揮調(diào)控作用。miRNA表達異常會導(dǎo)致腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生，目前關(guān)于miRNA和腫瘤相關(guān)性的研究成為眾多科學(xué)家關(guān)注的熱點之一， miRNA可能成為腫瘤診斷、治療以及預(yù)后判斷新的靶點。
　　miR-335定位于人染色體7q32.2處，在正常組織中廣范表達。研究發(fā)現(xiàn)在不同腫瘤中扮演著復(fù)雜的角

3、色。在胃癌、乳腺癌中 miR-335呈現(xiàn)低表達，高表達 miR-335可以導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低。而在星型細胞瘤中剛發(fā)現(xiàn)miR-335高表達可以促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作。因而 miR-335的不同作用可能具有組織特異性，目前關(guān)于 miR-335在非小細胞肺癌細胞的生物學(xué)作用及調(diào)控的分子機制仍然不是很清楚。
　　本課題計劃包含以下三部分：第一部分：非小細胞肺癌組織中 miR-335和Sp1、Bcl-w表達及與臨床病理學(xué)特征相關(guān)性

4、分析；第二部分：上調(diào)miR-335表達對非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549生物學(xué)作用的影響；第三部分：miR-335對Sp1、Bcl-W轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用機制的初步研究。
　　第一部分非小細胞肺癌組織中miR-335和Sp1、Bcl-w表達及與臨床病理學(xué)特征相關(guān)性分析
　　方法：
　　1.收集手術(shù)切除的72例非小細胞肺癌組織及相對應(yīng)的癌旁正常組織標本。
　　2.采用 Agilent miRNA芯片檢測3例非小細胞肺癌組織及相

5、對應(yīng)的癌旁正常組織標本中miRNA表達情況，分析差異化表達的miRNA。
　　3.運用qRT-PCR檢測72例樣本中miR-335和Sp1、Bcl-w mRNA表達，Spearman相關(guān)分析miR-335表達與Sp1/Bcl-w mRNA表達的相關(guān)性。
　　4. Western-blot檢測Sp1和Bcl-w蛋白表達
　　5.分析miR-335和Sp1、Bcl-w mRNA的表達水平與非小細胞肺癌病人性別，年齡、腫瘤分

6、化、TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。
　　6.應(yīng)用SPSS18.0.軟件進行統(tǒng)計分析，檢驗水準а＝0.05。
　　結(jié)果：
　　1. Agilent miRNA芯片檢測分析顯示共有56個miRNAs在非小細胞肺癌組織中表達異常，其中26個miRNAs表達上調(diào)，30個miRNAs表達下調(diào)。miR-335在非小細胞肺癌中呈低表達（P＜0.05）。
　　2. qRT-PCR檢測顯示在非小細胞肺癌組織中，miR-3

7、35表達水平較正常組織顯著降低（P＜0.05），其表達水平和Sp1、Bcl-w的mRNA表達水平呈負相關(guān)（R2分別為0.5231和0.6375）。
　　3.非小細胞肺癌組織中miR-335的表達水平與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度以及TNM分期有關(guān)（P＜0.05）。
　　第二部分上調(diào)miR-335表達對非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549生物學(xué)作用的影響
　　方法：
　　1.合成miR-335前體序列，在其兩端引入XhoⅠ

8、和EcoRⅠ酶切位點，將其克隆到慢病毒載體pGV中，構(gòu)建慢病毒載體pGV-miR-335。
　　2.將 pGV-miR-335、pHelper1.0、pHelper2.0質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至慢病毒包裝細胞HEK-293T中，包裝產(chǎn)生慢病毒并測定滴度。
　　3.慢病毒感染A549細胞，篩選得到穩(wěn)定感染的細胞株，qRT-PCR檢測慢病毒感染后A549細胞中miR-335表達。
　　4.將細胞分為三組：實驗組（重組 miR-335慢

9、病毒感染細胞），無關(guān)對照組（miR-NC慢病毒感染細胞）；空白組（未感染A549細胞）。
　　5. CCK-8法、平板克隆形成實驗檢測各組細胞增殖和生長能力。
　　6. AnncxinV-FITC/PI雙標記流式細胞術(shù)、Hoechst染色、Caspase-3檢測各組細胞凋亡情況。
　　7. Transwell小室實驗、劃痕實驗檢測各組細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力
　　8.裸鼠移植瘤實驗檢測miR-335過表達對非小細胞肺癌A

10、549細胞裸鼠移植瘤的影響。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)雙酶切鑒定和測序表明成功構(gòu)建了含有miR-335的慢病毒載體，其感染A549細胞后miR-335的相對表達量較空白細胞組和無關(guān)對照組顯著升高（P<0.01）。
　　2. CCK-8法檢測結(jié)果顯示miR-335組細胞較無關(guān)對照組以及空白對照組吸光度顯著減少。平板克隆形成實驗結(jié)果顯示miR-335組細胞克隆形成數(shù)較空白對照組細胞和無關(guān)對照組著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0

11、.05）。
　　3. AnncxinV-FITC/PI雙標記流式細胞術(shù)和Hoechst染色檢測顯示重組miR-335慢病毒感染后A549細胞凋亡率較空白對照組和無關(guān)對照組顯著升高，Caspase-3細胞活性較空白對照組和無關(guān)對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4. Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)實驗組穿膜細胞數(shù)為（20.7±2.6）個，較空白對照組和無關(guān)對照組顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。劃

12、痕實驗顯示重組miR-335慢病毒感染A549細胞后，實驗組劃痕48h后劃痕愈合速度明顯慢于空白對照組和無關(guān)對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5.裸鼠移植瘤實驗表明實驗組瘤塊體積較正常對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　第三部分 miR-335對SP-1、Bcl-W轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用機制的初步研究
　　方法：
　　1.通過生物信息學(xué)分析推測miR-335的候選靶基因。
　　2.

13、構(gòu)建重組載體pmirGLO-w-Sp1、pmirGLO-mut-Sp1、pmirGLO-w-Bcl-w、pmirGLO-mut-Bcl-w。采用雙熒光素酶報告實驗驗證miR-335的靶基因。
　　3.構(gòu)建表達載體pcDNA3.1-Sp1、pcDNA3.1-Bcl-w，通過回復(fù)實驗分析miR-335對A549生物學(xué)活性的調(diào)控。
　　4.設(shè)計靶向Sp1和Bcl-w的siRNA序列，轉(zhuǎn)染至A549細胞。分為以下5組：未轉(zhuǎn)染的A54

14、9細胞（Blank組）、miR-335慢病毒感染的A549細胞（miR-335組）、Sp1 siRNA干擾表達的A549細胞（SP↓組），Bcl-w siRNA干擾表達的A549細胞（Bcl-w↓組），Sp1 siRNA和Bcl-w同時干擾表達的A549細胞（SP↓Bcl-w↓組）。qRT-PCR、Western blot檢測各組細胞Sp1/Bcl-w mRNA和蛋白表達， CCK-8法檢測各組細胞增殖，AnncxinV-FITC/PI

15、雙標記流式細胞術(shù)檢測各組凋亡， Transwell小室實驗檢測各組侵襲能力的變化
　　結(jié)果：
　　1.生物信息學(xué)分析推測Sp1、Bcl-w為miR-335靶基因。
　　2.雙熒光素酶報告實驗顯示miR-335可以與Sp1、Bcl-w的3' UTR區(qū)結(jié)合，對其表達產(chǎn)生負調(diào)控作用。
　　3.將不含Sp1和Bcl-w3' UTR區(qū)的重組載體pcDNA3.1-Sp1、pcDNA3.1-Bcl-w轉(zhuǎn)染至A549細胞后，可以

16、回復(fù)miR-335對Sp1和Bcl-w蛋白表達的負調(diào)控作用，同時回復(fù)了miR-335抑制A549細胞轉(zhuǎn)移，促進細胞凋亡的能力。
　　4.過表達miR-335在A549細胞中可以起到和Sp1和Bcl-w siRNA相似的生物學(xué)效應(yīng)，且較siRNA干擾能更有效的抑制A549細胞增殖、促進細胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.共有56個miRNAs在非小細胞肺癌組織中表達異常，其中26個miRNAs表達上調(diào)，30個miRNAs表達

17、下調(diào)。在非小細胞肺癌組織中，miR-335表達水平較正常組織顯著降低。其表達水平與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度以及TNM分期有關(guān)。
　　2.成功建立了高表達miR-335的非小細胞肺癌A549細胞株。體外上調(diào)非小細胞肺癌細胞中miR-335表達可有效抑制胞的生長、降低細胞侵襲能力，并且促進細胞的凋亡。動物實驗表明miR-335高表達能有效抑制裸鼠移植瘤生長。
　　3. miR-335是通過作用于靶基因Sp1和Bcl-w mRN