乙醛脫氫酶2對高脂誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙的影響及其機制研究.pdf

1、論文Ⅰ
　　乙醛脫氫酶2對高脂誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙的影響及其機制研究
　　背景：
　　目前心血管疾病如冠心病、高血壓和糖尿病心血管并發(fā)癥發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)成為危害中國和世界人民健康的“頭號殺手”，如何提高心血管疾病的預(yù)防和診治水平已經(jīng)成為目前迫切需要解決的重大醫(yī)學(xué)和社會問題。這些疾病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)都是血管病變，即血管功能障礙和結(jié)構(gòu)異常。然而目前對于血管內(nèi)皮功能和結(jié)構(gòu)的調(diào)控、病變發(fā)生的分子機制以及干預(yù)靶點還不十分清

2、楚。
　　血管內(nèi)皮功能障礙主要表現(xiàn)為內(nèi)皮依賴性血管舒張功能降低、炎癥反應(yīng)以及血管通透性增加等;胰島素抵抗是指機體的效應(yīng)器官或組織對胰島素作用不敏感的一種病理生理現(xiàn)象，與冠心病、糖尿病和肥胖等許多代謝和心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，這些疾病在發(fā)生的早期均有不同程度的血管內(nèi)皮功能障礙和胰島素抵抗。通常胰島素抵抗和血管內(nèi)皮功能障礙共同存在、相互促進(jìn)。胰島素抵抗的患者一般會同時存在有胰島素誘導(dǎo)的血管舒張功能減弱。研究表明，在高糖、高脂、

3、炎癥因子、氧化應(yīng)激等心血管致病因素刺激下，胰島素信號傳導(dǎo)通路受損，引起胰島素抵抗，胰島素通過IRS-PI3K-Akt信號通路刺激血管內(nèi)皮產(chǎn)生NO減少，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。
　　NLRP3炎癥小體是目前研究最多的一種炎癥小體。NLRP3屬于NOD樣受體(NLR)家族蛋白，它可以被高糖、高脂、炎癥因子、氧化應(yīng)激等致病因素以及其他各種類型的分子、細(xì)菌和病毒所激活，然后與Caspase和ASC共同形成高分子量的蛋白復(fù)合體，即為“炎癥小體

4、”，從而活化Caspase-1，促進(jìn)IL-1β前體分子的成熟和釋放，引起炎癥反應(yīng)。目前對于NLRP3炎癥小體的激活和調(diào)控機制還不是很清楚。研究認(rèn)為，活性氧物質(zhì)(ROS)可以激活NLRP3炎癥小體，ROS能夠使TXNIP與TRX解離，從而使TXNIP與NLRP3結(jié)合，進(jìn)而激活NLRP3炎癥小體。最近，Zhou等人發(fā)現(xiàn)來源于線粒體的ROS對于NLRP3炎癥小體的激活具有非常關(guān)鍵的作用。NLRP3炎癥小體與許多疾病密切相關(guān)，最新研究表明它在動

5、脈粥樣硬化和糖尿病的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用，是二者共同的危險因素。
　　乙醛脫氫酶(ALDH2)是人體內(nèi)乙醇代謝的關(guān)鍵酶，主要存在于線粒體。除催化乙醇代謝產(chǎn)物乙醛氧化為乙酸外，它還可以將其他毒性醛類物質(zhì)如4-壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal，4-HNE）氧化為無毒性的相應(yīng)酸，具有一定的抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)ALDH2與心血管疾病密切相關(guān)，可以減輕心肌梗死、糖尿病以及飲酒等引起的心臟功能損傷、心肌細(xì)胞凋亡和線粒體功

6、能障礙等。目前我們課題組已經(jīng)證實糖尿病大鼠體內(nèi)ALDH2的活性明顯下降，其機制可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。許多研究包括2012年最新的全基因組序列分析已經(jīng)證實ALDH2是冠心病的易感基因。
　　基于以往的研究基礎(chǔ)，我們推論:1、NLRP3炎癥小體的激活在高脂誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙的過程中具有重要作用;2、ALDH2可以通過胰島素信號通路改善高脂誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙，其機制可能是通過對NLRP3炎癥小體的調(diào)控。
　　目的：
　　

7、本課題的研究目的是探討:
　　1.NLRP3炎癥小體在高脂誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙中的作用及機制。
　　2.ALDH2對高脂誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙的影響以及可能的機制。
　　3.ALDH2對NLRP3炎癥小體的調(diào)控及其機制。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):本實驗選用購自美國ATCC公司的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，培養(yǎng)基為含5％胎牛血清的ECM培養(yǎng)基。利用棕櫚酸(Palmiticacid, PA)加脂多糖

8、(LPS)刺激HUVECs誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙。
　　2.動物模型:7周齡左右雄性C57BL/6J小鼠40只（體重20g左右），隨機分為4組，為對照+GFP病毒組、高脂+GFP病毒組、對照+ALDH2病毒組、高臘+ALDH2病毒組。對照組給予標(biāo)準(zhǔn)普通飼料飲食和高脂組給予含60％能量的高臘飲食(HFD)。10周后分別給予小鼠尾靜脈注射GFP慢病毒和ALDH2過表達(dá)慢病毒。12周后處死，留取小鼠主動脈血管等組織標(biāo)本進(jìn)行檢測。
　　3

9、.慢病毒轉(zhuǎn)染:各組HUVECs刺激前轉(zhuǎn)染GFP和ALDH2過表達(dá)慢病毒，轉(zhuǎn)染48小時后再給予LPS+PA刺激。
　　4.小干擾RNA轉(zhuǎn)染:HUVECs刺激前分組轉(zhuǎn)染人NLRP3、Caspase-1和ASC的小干擾RNA，干擾48小時后再給予LPS+PA刺激。
　　5.實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR):收集各組HUVECs，提取RNA后進(jìn)行RT-PCR，檢測各組細(xì)胞中ALDH2 mRNA的表達(dá)水平。
　　6.ALDH

10、2活性測定:提取細(xì)胞線粒體蛋白與ALDH2底物乙醛或丙醛反應(yīng)，測定ALDH2的活性。
　　7.蛋白印跡法(Western blot，WB):各組刺激后收集HUVECs，提取蛋白，統(tǒng)一蛋白濃度。分別檢測p-eNOS(Ser1177)、t-eNOS、p-Akt(Ser473)、t-Akt、p-AMPKα(Thr172)、 t-AMPKα、 NLRP3、 ASC、 Pro-Caspase-1、 cleavedCaspase-1(p10)

11、、Pro-IL-1β、IL-1β、ALDH2和β-actin等蛋白的表達(dá)水平。
　　8.統(tǒng)計分析:數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。p＜0.05認(rèn)為是有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.PA顯著抑制IRS-1-Akt-eNOS信號通路的活性。
　　與正常對照組和LPS組相比，單獨加不同濃度PA刺激可以降低p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表達(dá)，但是總的Akt和e

12、NOS表達(dá)沒有改變;在不同濃度PA刺激前提前加入LPS預(yù)刺激，可以更加顯著的降低Akt和eNOS的磷酸化表達(dá)。
　　2.NLRP3小體介導(dǎo)了PA對胰島素信號通路活性的損傷。
　　WB結(jié)果顯示:與正常對照組和LPS組相比，單獨加不同濃度PA刺激沒有改變NLRP3炎癥小體、cleaved Caspase-1(p10)和IL-1β蛋白的表達(dá)，而在不同濃度PA刺激前提前加入LPS預(yù)刺激，沒有改變NLRP3炎癥小體的表達(dá)，但是可以顯著

13、的增加cleaved Caspase-1(p10)和IL-1β蛋白的表達(dá)。不同濃度的IL-1β刺激可以顯著降低p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表達(dá)，不改變Akt和eNOS總蛋白表達(dá)。利用siRNA抑制NLRP3炎癥小體表達(dá)后，IL-1β蛋白的表達(dá)明顯減少，p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表達(dá)有了明顯的改善。
　　3.AMPKα負(fù)性調(diào)節(jié)PA對NLRP3炎癥小體的激活。
　

14、　與正常對照組和LPS組相比，單獨加不同濃度PA刺激可以降低p-AMPKα(Thr172)的表達(dá)而不改變總的AMPKα的表達(dá)，而在不同濃度PA刺激前提前加入LPS預(yù)刺激，可以更加顯著的降低p-AMPKα(Thr172)的表達(dá)。加入AMPK激活劑AICAR后，cleaved Caspase-1(p10)和IL-1β蛋白的表達(dá)明顯減少，p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表達(dá)有了明顯的改善。
　　4.增加ALD

15、H2的蛋白表達(dá)改善胰島素信號通路的活性。
　　HUVECs轉(zhuǎn)染ALDH2過表達(dá)慢病毒增加ALDH2蛋白表達(dá)后，p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表達(dá)可以得到明顯改善。
　　5.增加ALDH2的蛋白表達(dá)可以通過激活A(yù)MPKα來抑制NLRP3炎癥小體的激活。
　　WB結(jié)果顯示:ALDH2過表達(dá)慢病毒可以使AMPKα磷酸化增加，cleavedCaspase-1(p10)和IL-1β蛋白的表達(dá)明顯減少

16、
　　6.ALDH2可以明顯改善小鼠主動脈內(nèi)皮IRS-1-Akt-eNOS信號通路的活性。
　　小鼠體內(nèi)實驗顯示:與普通飲食相比，單獨ALDH2過表達(dá)沒有影響Akt和eNOS的磷酸化，HFD可以明顯降低p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表達(dá)，但是與HFD組相比，ALDH2過表達(dá)可以明顯恢復(fù)HFD引起的Akt和eNOS的磷酸化抑制。
　　7.在小鼠主動脈內(nèi)皮，ALDH2可以激活A(yù)MPK、抑制NL

17、RP3炎癥小體的激活。
　　小鼠主動脈內(nèi)皮的WB結(jié)果顯示:各組NLRP3炎癥小體的蛋白表達(dá)沒有改變。與普通飲食相比，單獨ALDH2過表達(dá)沒有改變p-AMPKα(Thr172)、cleavedCaspase-1(p10)和IL-1β的表達(dá)，HFD可以明顯抑制AMPKα的磷酸化、增加cleaved Caspase-1(p10)和IL-1β的表達(dá)，但是與HFD組相比，HFD+ALDH2過表達(dá)可以明顯增加p-AMPKα(Thr172)的表

18、達(dá)、降低cleaved Caspase-1(p10)和IL-1β的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.高脂通過激活NLRP3炎癥小體損傷胰島素信號通路，進(jìn)而引起血管內(nèi)皮功能障礙;
　　2.AMPKα介導(dǎo)了高脂對NLRP3炎癥小體的激活;
　　3.ALDH2可以通過增加胰島素信號通路的活性來改善高脂誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙，其機制可能與增加AMPKα的活性進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體的激活有關(guān)。
　　論文Ⅱ
　　U

19、LK1在一氧化氦(NO)調(diào)節(jié)SIRT1表達(dá)中的作用及其機制研究
　　背景：
　　SIRT1是依賴于NAD+的第三類組蛋白去乙酰化酶，主要分布于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也有。它廣泛存在于各種組織中，除組蛋白外，還作用于多種非組蛋白如p53、FOXO、eNOS、iNOS、NF-κB、PARP-1等，參與調(diào)控DNA修復(fù)、氧化應(yīng)激、炎癥、糖脂代謝、細(xì)胞衰老等多種生理病理過程，對代謝綜合征、動脈粥樣硬化、糖尿病和衰老等多種心血管疾病具有重要作

20、用。健康的血管內(nèi)皮功能依賴內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生。NO具有舒張血管活性，可以抑制動脈粥樣斑塊的聚集和促進(jìn)血管新生。研究發(fā)現(xiàn)，eNOS生成NO需要SIRT1去乙?；钚裕琒IRT1也可以保護(hù)炎癥和凋亡誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能。
　　探討SIRT1的調(diào)控機制非常重要，它可以為這些疾病提供新的治療靶點。但是目前SIRT1蛋白調(diào)控的機制還不是很清楚。研究表明，eNOS可以正向調(diào)節(jié)SIRT1蛋白的表達(dá)。而且S

21、IRT1可以被p38蛋白激酶介導(dǎo)的蛋白酶體所降解，引起細(xì)胞衰老。最近研究證實eNOS產(chǎn)生的NO是26s蛋白酶體功能的內(nèi)源性抑制劑。
　　因此基于以上研究基礎(chǔ)，我們推測: NO可以通過抑制26s蛋白酶體活性來增加SIRT1蛋白表達(dá)。
　　目的：
　　本課題的研究目的是探討:NO對SIRT1蛋白表達(dá)的調(diào)控及其機制。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)、人胚胎腎臟上皮細(xì)胞系(HEK29

22、3T與HEK293AD)和GFPu-1細(xì)胞購自美國ATCC公司(Manassas，VA);表達(dá)GFP-LC3B的U20S細(xì)胞購自EMD Millipore（Billerica，MA）;小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)來源于Ulk1-/-，Ulk2-/-，Ulk1-/-/2-/-和WT小鼠。HUVECs培養(yǎng)基為含5％FBS的EBM培養(yǎng)基;MEF、HEK293T、U20S和GFPu-1細(xì)胞的培養(yǎng)基為含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基。
　　2

23、.動物實驗:雄性eNOS敲除小鼠（10周齡）和db/db小鼠（25周齡）和相同周齡的C57BL/6JWT小鼠從Jackson lab購買。
　　3.腺病毒、質(zhì)粒和小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染:
　　腺病毒轉(zhuǎn)染:HUVECs和MEF細(xì)胞轉(zhuǎn)染eNOS和GFP對照的腺病毒48小時。
　　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染UbG76V-GFP質(zhì)粒48小時。
　　siRNA轉(zhuǎn)染:HUVECs按照Santa Cruz公司提供

24、的方法轉(zhuǎn)染對照或者ULK1和β-TrCP1的siRNA48小時，
　　4.RT-PCR:使用總RNA提取試劑盒從HUVECs和HEK293T細(xì)胞提取總的RNA，然后用RT-PCR測定SIRT1和18s mRNA的水平。
　　5.26S蛋白酶體活性測定:使用含熒光的蛋白酶體底物AMC來測定糜蛋白酶樣活性來作為26蛋白酶體的活性，是ATP依賴的清除活性，具體是在37℃，380/460 nm波長條件下，用熒光酶標(biāo)儀測定游離AMC的

25、水平。
　　6.糖基化修飾蛋白測定:用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，用WGA方法測定糖基化修飾蛋白的表達(dá)水平。
　　7.蛋白印跡法(Western blot，WB):收集細(xì)胞后，提取蛋白，統(tǒng)一蛋白濃度，測定ULK1、OGT、eNOS、SIRT1、O-GlcNAc、LC3B，、Beclin-1、p62、β-TrCP1、GFP、Rpt2、β7和β-actin蛋白的表達(dá)水平。
　　8.統(tǒng)計分析:數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS

26、軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。p＜0.05認(rèn)為是有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，NO穩(wěn)定和增加SIRT1的表達(dá)。
　　增加eNOS表達(dá)可以明顯的增加SIRT1的表達(dá)，eNOS的激動劑A23187和直接的一氧化氮NONOate可以增加SIRT1的表達(dá)，且具有時間依賴性，但是沒有改變SIRT1的mRNA表達(dá)水平。追逐實驗表明:不同時間點，CHX可以降低SIRT1蛋白表達(dá)，NONOate可以顯著的增加SIRT

27、1的穩(wěn)定性。另外，MG132作為一種26S蛋白酶體的抑制劑可以上調(diào)SIRT1的表達(dá)。
　　2.在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，NO穩(wěn)定和增加ULK1的表達(dá)。
　　eNOS過表達(dá)可以明顯的增加ULK1的表達(dá)，不同的時間條件下，A23187和NONOate也可以增加ULK1的表達(dá);同樣在追逐實驗中，NONOate和A23187都可以顯著的增加SIRT1的穩(wěn)定性。
　　3.ULK1介導(dǎo)了NO對SIRT1的調(diào)控。
　　在WT和Ulk2

28、-/-MEF細(xì)胞，eNOS過表達(dá)或者NONOate可以明顯的增加SIRT1的表達(dá)，但是在Ulk1-/-和Ulk1-/-/2-/-MEF細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)沒有增加。在HUVECs中，與對照組相比，A23187和NONOate可以增加SIRT1蛋白的表達(dá)，用siRNA抑制ULK1表達(dá)以后，A23187和NONOate沒有增加SIRT1蛋白的表達(dá)。在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ULK1質(zhì)粒后，SIRT1蛋白的表達(dá)明顯升高，但是mRNA水平?jīng)]有

29、改變。
　　4.NO或者ULK1對SIRT1的調(diào)控不依賴于自噬。
　　雷帕霉素可以激活LC3B和自噬小體，但是不能增加SIRT1的表達(dá);NONOate對自噬小體的影響很小，而且NONOate、eNOS和A23187沒有改變自噬相關(guān)蛋白（p62、Beclin-1和LC3B）的表達(dá);在MEF細(xì)胞中，自噬的抑制劑BafA1沒有恢復(fù)SIRT1的表達(dá)。
　　5.ULK1可以調(diào)控26S蛋白酶體的功能。
　　GFPu-1細(xì)胞（

30、檢測26S蛋白酶體活性的工具細(xì)胞）過表達(dá)ULK1后，GFP蛋白表達(dá)增加，GFP熒光增強，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后26S蛋白酶體活性降低;MEF細(xì)胞轉(zhuǎn)染UbG76V-GFP（一種26S蛋白酶體的檢測工具與GFPu-1相似）質(zhì)粒后，GFP表達(dá)明顯降低，Ulk1-/-MEF和siULK1轉(zhuǎn)染HUVECs都可以增加26S蛋白酶體活性。
　　6.OGT介導(dǎo)了ULK1對26S蛋白酶體的調(diào)控。
　　ULK1過表達(dá)顯著增加OGT蛋白表達(dá)

31、和糖基化修飾水平。使用WGA富集糖基化修飾蛋白，發(fā)現(xiàn)ULK1過表達(dá)可以增加Rpt2的糖基化。相反，使用siRNA抑制ULK1表達(dá)可以降低OGT蛋白表達(dá)和糖基化修飾水平，而且加入NONOate刺激后OGT蛋白表達(dá)和糖基化修飾水平不再增加。
　　7.在eNOS敲除小鼠和db/db小鼠組織可以驗證NO-ULK1-SIRT1通路。
　　eNOS敲除小鼠的肺臟組織中，ULK1和SIRT1蛋白表達(dá)明顯下降;在2型糖尿病db/db小鼠的肺