家蠶BmToll9和BmMLs響應(yīng)LPS引發(fā)的免疫反應(yīng).pdf

1、作為Ⅰ-型跨膜受體Toll樣受體(Toll-like-reception，TLRs)，是天然免疫中最重要的模式識(shí)別受體（pathogen recognition receptor，PRR）。作為最古老的受體家族之一，TLRs廣泛存在于昆蟲(chóng)和脊椎動(dòng)物中。昆蟲(chóng)中的Toll除了參與先天免疫還參與控制早期果蠅胚胎背腹軸的發(fā)育，無(wú)論是哪條途徑，Toll都是通過(guò)胞外識(shí)別因子和蛋白酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)激活sp?tzle配體起作用。而在哺乳動(dòng)物中，TLR能作為模

2、式識(shí)別受體PRR直接識(shí)別特定的病原物相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。通過(guò)對(duì)TLR結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，脊椎動(dòng)物和昆蟲(chóng)之間確實(shí)存在著不同，那么TLR的祖先功能到底是什么？其在免疫上的關(guān)鍵受體作用是在昆蟲(chóng)和脊椎動(dòng)物分化之前就存在，還是分化之后的趨同進(jìn)化？這成為一個(gè)有爭(zhēng)議的熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　基于以上問(wèn)題，本研究以家蠶為模式生物，進(jìn)行了以下內(nèi)容的研究：（1）通過(guò)生物信息學(xué)分

3、析了哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)等的TLR在進(jìn)化上的關(guān)系。（2）以家蠶BmToll9為靶標(biāo)，BLAST分析家蠶基因組中是否存在與哺乳動(dòng)物TLR4配體MD2功能類(lèi)似的ML家族蛋白。（3）通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)研究家蠶ML家族蛋白與不同微生物組分的結(jié)合特性。（4）通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)家蠶BmToll9是否能夠與配體ML家族蛋白識(shí)別結(jié)合。（5）在家蠶Bm12細(xì)胞中超表達(dá)BmToll9，LPS誘導(dǎo)后檢測(cè)是否能引起下游抗菌肽的表達(dá)。
　　本論文獲得了以下結(jié)

4、果：
　　（1）通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)等TLR的進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)的TLR分屬兩個(gè)不同的分支，只有Toll9是個(gè)例外。BmToll9的結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物TLR4受體結(jié)構(gòu)極為相似，都含有745個(gè)氨基酸，具有典型的跨膜結(jié)構(gòu)域，其中1-550位氨基酸為胞外區(qū)域LRRs，同時(shí)在其末端C-端側(cè)翼有一個(gè)保守的Cys基序。
　?。?）對(duì)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST搜索，尋找到了三條ML蛋白質(zhì)序列：BmPP，BmEsr16和BmML

5、-1。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得了這3條基因序列，克隆至原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化E.coli，經(jīng)純化獲得BmPP、BmEsr16和BmML-1重組蛋白質(zhì)。通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BmEsr16和BmML-1與不同的微生物組分都有結(jié)合特性。推測(cè)家蠶中的BmMLs可能參與了與細(xì)菌PAMP的識(shí)別。
　?。?）構(gòu)建重組載體pIEX-4-Toll9-exto（BmToll9的胞外區(qū)部分），pIEX-4-BmML-1，pIEX-4-BmPP，pIE

6、X-4-BmEsr16，轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞，通過(guò)BT抗生素篩選出穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞系。
　　（4）通過(guò)免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，BmToll9蛋白與BmPP和BmEsr16蛋白均可以結(jié)合。暗示家蠶BmToll9與哺乳動(dòng)物中TLR4蛋白功能類(lèi)似，可以與MLs家族蛋白結(jié)合。
　?。?）克隆BmToll9基因的全長(zhǎng)序列，構(gòu)建到含有eGFP熒光標(biāo)簽的表達(dá)載體pIEX-4-eGFP中，轉(zhuǎn)染家蠶Bm12細(xì)胞，共聚焦顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BmToll9成