同種大白兔頸動(dòng)脈移植后血管一氧化氮合酶活性變化的意義.pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文同種大白兔頸動(dòng)脈移植后血管一氧化氮合酶活性變化的意義姓名：朱兵申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：兒科學(xué)指導(dǎo)教師：李心元20020301統(tǒng)分析儀、S一500P型紫外線可見(jiàn)光連續(xù)分光光度儀(法國(guó)SECOMAM公司)、總RNA提取及eDNA合成試劑盒(日本TaKaRa生物技術(shù)有限公司)、ecNOS／iNOS引物(北京奧科生物工程公司)、NO試劑盒(南京建成生物工程研究所)、ecNOS／iNOS免疫組織化學(xué)試劑金(內(nèi)含羊抗兔ecN

2、OS／iNOS多克隆抗體血清和sP通用型試劑盒，北京中山生物工程公司)、RPMI1640營(yíng)養(yǎng)液(美國(guó)GibeoBRL公司)、DMSO(德國(guó)Merck公司)、青霉素鈉(PC，400萬(wàn)單位)、硫酸鏈霉索(SM，100萬(wàn)單位)。3動(dòng)物模型：按人類(lèi)無(wú)菌手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行各種試劑配制及自體／異體頸動(dòng)脈移植手術(shù)。其中，A組采用自體血管原位植入。B組采用新采集的異體血管，肝素鹽水(HNS，25IO／m1)沖洗后立即植入受者頸動(dòng)脈。C組采用PC／SM(50I

3、u／fnl)處理后室溫密閉保存(72小時(shí)內(nèi)使用)的異體血管植入。D組植入PC／SM(50IU／m])處理后液氮保存的血管。術(shù)后觀察I一4周。取材時(shí)記錄移植動(dòng)脈周?chē)淖兗皠?dòng)脈外觀、直徑、通暢、狹窄及程度。采集受者血漿和植入血管等標(biāo)本分別保存于EDTA一2Na／抑肽酶塑料管和液氮中備檢。。4檢測(cè)指標(biāo)：(1)血漿NO濃度(硝酸還原酶法)：按照NO試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。(2)移植血管病理學(xué)改變(HE染色法)：從形態(tài)上單盲法觀察記錄移植血管腔內(nèi)有無(wú)血

4、栓及血栓性質(zhì)、管壁各層結(jié)構(gòu)是否清晰可辨、Lc浸潤(rùn)情況、細(xì)胞漿有無(wú)強(qiáng)嗜酸性反應(yīng)、核染色質(zhì)濃縮邊集、核固縮或核碎裂、強(qiáng)嗜堿性小體形成及內(nèi)膜下及中膜增生程度。(3)iNOS／eeNOS活性(免疫組化染色法)：按照iNOS／eeNOS免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作對(duì)盤(pán)管組織切片進(jìn)行免疫組化染色。單盲法觀察記錄著色(深棕色)部位、顆粒大小及著色密度、染色細(xì)胞多寡并分級(jí)評(píng)分，o分：陰性(一)，1分：弱陽(yáng)性()，2分：中度陽(yáng)性()，3分：強(qiáng)陽(yáng)性()。統(tǒng)計(jì)表

5、達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度。(4)iNOS／ecNOSmRNA表達(dá)(1it—PCR法)：用提取的血管組織總PdqA合成eDNA，用PrimerPremiere軟件分別以兔科iNOS／eeNOS基因序列設(shè)計(jì)引物序列并按設(shè)計(jì)條件進(jìn)行擴(kuò)增。其中ecNOS—U序列：57一孵CCGCTACCAGCCAGAC一3’；eeNOS—L序列：5’一CGAGGGACACCACATCATAC一37；iNOS—U序列：5’一CATTGCATTCAGATcCCGAAACG一