小鼠IL-23基因在小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其抗腫瘤作用研究.pdf

1、本研究在已有工作的基礎(chǔ)上首先以結(jié)腸癌細(xì)胞株(Colon26)為基礎(chǔ)，構(gòu)建表達(dá)IL-23的結(jié)腸癌細(xì)胞株(Colon26/IL-23)，為深入研究IL-23的抗腫瘤作用，皮下接種小鼠觀察IL-23的抗腫瘤作用，并進(jìn)一步探討IL-23抗腫瘤過(guò)程中細(xì)胞凋亡的變化及細(xì)胞凋亡抑制因子Survivin的表達(dá)情況。 研究方法：將攜帶mIL-23的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞株(PA317/IL-23)在完全培養(yǎng)基DMEM中，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2

2、4h，收集帶有mIL-23基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的上清液。以polybrene介導(dǎo)將攜帶mIL-23基兇的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體結(jié)腸癌細(xì)胞(Colon26)，經(jīng)G418(400mg/L)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性克隆細(xì)胞(Colon26/IL-23)。用DMEM培養(yǎng)這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陽(yáng)性克隆細(xì)胞，待細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，用飽和酚-氯仿法提取陽(yáng)性克隆細(xì)胞DNA，PCR鑒定目的基因是否整合到小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞基因組中。用Trizol提取陽(yáng)性克隆細(xì)胞RNA

3、，RT-PCR鑒定Colon26/IL-23目的基因mRNA的表達(dá)。用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液mIL-23分泌量。無(wú)菌取6周齡BALB/c小鼠脾臟，制成脾細(xì)胞懸液，加入Colon26/IL-23細(xì)胞培養(yǎng)上清液，培養(yǎng)48小時(shí)，收集上清液，用ELISA方法檢測(cè)IL-23刺激脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的含量。用MTT比色法檢測(cè)Colon26/IL-23、Colon26和Colon26/LXSN的體外增殖反應(yīng)。將上述三種細(xì)胞分別接種8-10周

4、齡BALB/c小鼠，觀察其致瘤作用，并用游標(biāo)卡尺定期測(cè)量腫瘤大小，確定IL-23的抗腫瘤作用。8-10周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分為四組，分別皮下接種Colon26/IL-23、Colon26和Colon26/LXSN，接種后10天、20天、30天皮下取瘤組織用流式細(xì)胞儀檢測(cè)瘤細(xì)胞凋亡率、用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)瘤細(xì)胞中細(xì)胞凋亡抑制因子Survivin的表達(dá)情況。 研究結(jié)果：含mIL-23的PA317/IL-23細(xì)胞培養(yǎng)上清液與小

5、鼠結(jié)腸癌細(xì)胞共同培養(yǎng)獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性克隆細(xì)胞(Colon26/IL-23)，比較Colon26/IL-23、Colon26/LXSN與Colon26三種細(xì)胞的基兇組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳，只在Colon26/IL-23細(xì)胞中擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為581bp的mIL-23p19亞基基因的PCR產(chǎn)物。將三種細(xì)胞的總RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)只在Colon26/IL-23細(xì)胞的RNA中有1條與mIL-23p19

6、亞基基因大小相同的約581bp的帶。只在Colon26/IL-23細(xì)胞的培養(yǎng)上清中檢測(cè)到mIL-23的分泌，分泌量為(95±1.76pg/ml)。Colon26/IL-23細(xì)胞培養(yǎng)上清液刺激小鼠脾細(xì)胞IFN-γ分泌量顯著高于Colon26/LXSN和Colon26的分泌量(P＜0.01)。三種細(xì)胞體外增值無(wú)明顯差異(P＞0.05)、而在體內(nèi)致腫瘤作用不司，在Colon26/IL-23細(xì)胞接種后的早期腫瘤生長(zhǎng)的速度及大小與Colon26/

7、LXSN和Colon26細(xì)胞接種組相似(P＞0.05)；在10d后，接種Colon26/IL-23細(xì)胞的小鼠腫瘤生長(zhǎng)的速度變緩慢，接種后30d瘤體明顯減小，42d開(kāi)始有小鼠腫瘤消退(P＜0.01)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，接種Colon26/IL-23細(xì)胞的小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率20天、30天有顯著差異(P＜0.01)。免疫組織化學(xué)染色，接種Colon26/IL-23細(xì)胞的小鼠腫瘤細(xì)胞Survivin的表達(dá)率與其它組相比20天、30天有顯著差異(P

8、＜0.01)。細(xì)胞凋亡率和Survivin的表達(dá)率作相關(guān)分析，二者呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=-0.6181。 研究結(jié)論：成功的構(gòu)建了Colon26/IL-23細(xì)胞，為深入研究IL-23抗腫瘤作用奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)體外刺激IFN-γ分泌和體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的研究，充分證明IL-23具有抗腫瘤作用。進(jìn)一步研究IL-23抗腫瘤對(duì)細(xì)胞凋亡的影響發(fā)現(xiàn)，隨著IL-23治療作用的延長(zhǎng)，Survivin的表達(dá)率逐漸減少，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，總之