DADS對人結(jié)腸癌細胞生長抑制作用及其差異表達基因分析.pdf

1、第一部分：DADS對人結(jié)腸癌HT-29細胞生長抑制作用的研究 目的：探討二烯丙基二硫(DADS)對人結(jié)腸癌HT-29細胞生長抑制作用的影響。方法：倒置顯微鏡和光鏡觀察不同濃度和作用時間DADS對體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌HT-29細胞形態(tài)的影響；MTT實驗、細胞計數(shù)法觀察不同濃度和作用時間DADS對HT-29細胞的生長抑制作用；流式細胞術(shù)分析不同濃度和作用時間DADS對HT-29細胞的周期分布；免疫細胞化學(xué)圖像定量分析不同濃度DADS誘

2、導(dǎo)HT-29細胞周期相關(guān)蛋白表達變化。結(jié)果：倒置顯微鏡觀察：60、90、120μmol/LDADS處理24h后，與對照組相比，部分HT-29細胞變圓，浮起于培養(yǎng)基中，浮起的細胞隨DADS濃度的增大和時間的延長而增加。光鏡觀察和圖象分析結(jié)果表明30、60、90、120μmol/LDADS處理細胞24、48、72h后，細胞形態(tài)沒有發(fā)生明顯的改變，與對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)?！　TT比色法檢測顯示：DADS能顯著抑制人

3、結(jié)腸癌HT-29細胞增殖，呈濃度和時間依賴性。60、120、240μmol/LDADS處理24h后，對癌細胞增殖的抑制率分別為23.1％、45.6％、56.5％(P0.05)，處理48h抑制率分別為28.4％、48.2％、65.3％與對照組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)?！　〖毎嫈?shù)結(jié)果表明：60、120μmol/LDADS對HT-29細胞具有明顯抑制作用；常規(guī)培養(yǎng)HT-29細胞群體倍增時間為22.58h，60、120μmol

4、/LDADS作用HT-29細胞48h后，其細胞群體倍增時間分別延長到31.2h、82.1h，與對照組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)?！　×魇郊毎g(shù)分析結(jié)果提示：低濃度組(30、60μmol·L-1)DADS作用HT-29細胞12、24h后阻滯細胞在G1期，與對照組比較，可使G1期細胞增加約2倍，差異有顯著性意義(P＜0.05)；而高濃度組(90、120μmol/L)DADS顯著地將細胞阻滯在G2/M期，差異有顯著性意義(P＜0

5、.01)?！　∶庖呒毎瘜W(xué)圖象定量分析表明：60、120μmol·L-1DADS作用HT-29細胞24h后，p21WAFl蛋白表達增強，與對照組比較，差異有顯著性意義(P＜0.01)；c-Myc表達降低(P＜0.01)；60μmol·L-1DADS時，CyclinE表達降低，差異有顯著性意義(P＜0.05)，而120μmo1·L-1DADS時，CyclinE表達水平較對照組無明顯改變(P＞0.05)；p53表達無顯著性差異(P＞0.0

6、5)。結(jié)論：1.DADS具有抑制結(jié)腸癌HT-29細胞的生長作用，并與細胞周期阻滯相關(guān)。2.低濃度DADS阻滯HT-29細胞在G1期，可能與p21WAF1蛋白表達上調(diào)，c-Myc、CyclinE蛋白表達下調(diào)有關(guān)。3.高濃度阻滯HT-29細胞在G2期，可能與p21WAF1蛋白表達上調(diào)，c-Myc蛋白表達下調(diào)相關(guān)?！　〉诙糠郑篋ADS抑制人結(jié)腸癌HT-29細胞生長相關(guān)基因的篩選及鑒定 目的：分離、鑒定DADS抑制人結(jié)腸癌HT-29

7、細胞生長的候選相關(guān)基因。方法：應(yīng)用抑制性消減雜交(Suppressionsubtractivehybridization，SSH)、T/A克隆、半定量RT-PCR等技術(shù)以及生物信息學(xué)方法分析DADS誘導(dǎo)HT-29細胞生長抑制相關(guān)基因的表達變化。結(jié)果：RNA提?。禾崛〉目俁NA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見明顯的三條(28S，18S和5S)，未見RNA降解和DNA污染。提取的mRNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，呈“smear”帶，紫外分光檢測顯示提取的未處

8、理和處理的HT-29細胞polyA+RNA分別為1.2μg和1.5μg，吸光度A260/A280＞1.90說明提取的mRNA質(zhì)量好，無DNA和RNA污染?！　SH實驗：消減產(chǎn)物與未消減樣品(對照)的PCR結(jié)果在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上明顯不同，前者可見清浙的條帶，后者呈瀑布狀?！　∠麥p有效性實驗：用看家基因(G3PDH)特異的引物作PCR，未消減樣品在15次循環(huán)時即可見擴增產(chǎn)物。而消減產(chǎn)物在循環(huán)數(shù)達30次才見擴增產(chǎn)物，這說明本實驗的消

9、減有效性高?！　〔町愊麥pcDNA文庫的建立及鑒定：T/A克隆后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌后，出現(xiàn)約500個白色克隆。隨機挑取100個白色克隆，提取質(zhì)粒DNA，EcoRI酶切、PCR分析發(fā)現(xiàn)73個克隆具有大小約100～1300bp的插入片段?！　》聪蛳麥p實驗：與上述SSH實驗相反，以誘導(dǎo)后結(jié)腸癌細胞提取的mRNA合成的cDNA作為驅(qū)趕子，誘導(dǎo)前癌細胞提取的mRNA合成的cDNA作為測試子，進行新一輪SSH，篩選出DADS誘導(dǎo)結(jié)

10、腸癌細胞前差異表達的基因。　　測序及生物信息學(xué)分析：將73個PCR、酶切均為陽性的克隆送交測序，其中68個克隆基因序列完整；另有3個克隆的基因序列中部分堿基不能確定；2個克隆無測序結(jié)果，都被剔除。用生物信息學(xué)方法將得到的68個基因序列在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫進行同源性比較。結(jié)果顯示，68個克隆中有38個是已知基因序列，1個新的EST，這些已知基因序列的同源性在95％-100％。正向消減文庫中包括細胞代謝及抗氧化相關(guān)基因(SOD1、A

11、RPC3、MTO1、citratesynthase、DNCL1、HNRPAB、FTH1、SPINT2、UBA52)；細胞周期及凋亡相關(guān)基因(p21、MRPS27、MM1、LGALS8)；參與蛋白活化、降解或信號傳導(dǎo)的基因(TACSTD2、S100A6、PSMD12、GNB1、GPCR175、NSFL1C)。其它功能不詳?shù)幕驗镽ibosomalproteinS3、DPCD、LOC144501、MGC41816、RPL35A、HTDP1。

12、反向消減文庫中包括細胞代謝相關(guān)基因(TRIP13、TRA1)；細胞周期及凋亡相關(guān)基因(PABPC1、YWHAE、RRM1)；參與蛋白活化、降解或信號傳導(dǎo)的基因(ATP1A1、ATP6AP1、FLJ25150fis、RAC1)；其它功能不詳?shù)幕驗镃LCP1、TMED5、KIAA0056protein、RPS6、Heatshockprotein8。這些基因中包括了幾十個以前在DADS的研究中從未涉及到的基因，生物信息學(xué)分析說明DADS在抗

13、結(jié)腸癌細胞生長過程中，不但有多種基因參與，而且還有一些我們尚不知道的基因也參與DADS的抗腫瘤應(yīng)答過程?！　“攵縍T-PCR：從正、反向文庫中隨機挑取10個基因進行半定量RT-PCR分析，這些基因在處理組及未處理組HT-29細胞中的表達具有顯著性差異(P＞0.05)，與SSH分析一致，表明SSH是一種鑒定差異表達基因的強有力的方法，建立的兩個差異表達cDNA文庫代表DADS誘導(dǎo)結(jié)腸癌生長抑制相關(guān)基因真實可靠。結(jié)論：1.應(yīng)用SSH技術(shù)

14、成功構(gòu)建了DADS誘導(dǎo)HT-29細胞差異表達基因的正、反向cDNA庫。2.p21、MM1表達上調(diào)，YWHAE、RRM1表達下調(diào)可能與DADS誘導(dǎo)HT-29細胞周期阻滯相關(guān)。3.TACSTD2、S100A6表達上調(diào)，PABP表達下調(diào)可能與DADS誘導(dǎo)胞漿Ca2+富集，啟動癌細胞凋亡有關(guān)。4.SOD1、FTH1、DNCL1表達上調(diào)可能與DADS抗氧化效應(yīng)有關(guān)。5.SPINT2、galectins-8表達上調(diào)，Rac1表達下調(diào)可能與抑制腫瘤細