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文檔簡介
1、第一部分:DADS對人結(jié)腸癌HT-29細胞生長抑制作用的研究 目的:探討二烯丙基二硫(DADS)對人結(jié)腸癌HT-29細胞生長抑制作用的影響。方法:倒置顯微鏡和光鏡觀察不同濃度和作用時間DADS對體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌HT-29細胞形態(tài)的影響;MTT實驗、細胞計數(shù)法觀察不同濃度和作用時間DADS對HT-29細胞的生長抑制作用;流式細胞術(shù)分析不同濃度和作用時間DADS對HT-29細胞的周期分布;免疫細胞化學(xué)圖像定量分析不同濃度DADS誘
2、導(dǎo)HT-29細胞周期相關(guān)蛋白表達變化。結(jié)果:倒置顯微鏡觀察:60、90、120μmol/LDADS處理24h后,與對照組相比,部分HT-29細胞變圓,浮起于培養(yǎng)基中,浮起的細胞隨DADS濃度的增大和時間的延長而增加。光鏡觀察和圖象分析結(jié)果表明30、60、90、120μmol/LDADS處理細胞24、48、72h后,細胞形態(tài)沒有發(fā)生明顯的改變,與對照組比較,差異無顯著性意義(P>0.05)?! TT比色法檢測顯示:DADS能顯著抑制人
3、結(jié)腸癌HT-29細胞增殖,呈濃度和時間依賴性。60、120、240μmol/LDADS處理24h后,對癌細胞增殖的抑制率分別為23.1%、45.6%、56.5%(P0.05),處理48h抑制率分別為28.4%、48.2%、65.3%與對照組比較,差異有顯著性意義(P<0.05)?! 〖毎嫈?shù)結(jié)果表明:60、120μmol/LDADS對HT-29細胞具有明顯抑制作用;常規(guī)培養(yǎng)HT-29細胞群體倍增時間為22.58h,60、120μmol
4、/LDADS作用HT-29細胞48h后,其細胞群體倍增時間分別延長到31.2h、82.1h,與對照組比較,差異有顯著性意義(P<0.05)?! ×魇郊毎g(shù)分析結(jié)果提示:低濃度組(30、60μmol·L-1)DADS作用HT-29細胞12、24h后阻滯細胞在G1期,與對照組比較,可使G1期細胞增加約2倍,差異有顯著性意義(P<0.05);而高濃度組(90、120μmol/L)DADS顯著地將細胞阻滯在G2/M期,差異有顯著性意義(P<0
5、.01)?! ∶庖呒毎瘜W(xué)圖象定量分析表明:60、120μmol·L-1DADS作用HT-29細胞24h后,p21WAFl蛋白表達增強,與對照組比較,差異有顯著性意義(P<0.01);c-Myc表達降低(P<0.01);60μmol·L-1DADS時,CyclinE表達降低,差異有顯著性意義(P<0.05),而120μmo1·L-1DADS時,CyclinE表達水平較對照組無明顯改變(P>0.05);p53表達無顯著性差異(P>0.0
6、5)。結(jié)論:1.DADS具有抑制結(jié)腸癌HT-29細胞的生長作用,并與細胞周期阻滯相關(guān)。2.低濃度DADS阻滯HT-29細胞在G1期,可能與p21WAF1蛋白表達上調(diào),c-Myc、CyclinE蛋白表達下調(diào)有關(guān)。3.高濃度阻滯HT-29細胞在G2期,可能與p21WAF1蛋白表達上調(diào),c-Myc蛋白表達下調(diào)相關(guān)?! 〉诙糠郑篋ADS抑制人結(jié)腸癌HT-29細胞生長相關(guān)基因的篩選及鑒定 目的:分離、鑒定DADS抑制人結(jié)腸癌HT-29
7、細胞生長的候選相關(guān)基因。方法:應(yīng)用抑制性消減雜交(Suppressionsubtractivehybridization,SSH)、T/A克隆、半定量RT-PCR等技術(shù)以及生物信息學(xué)方法分析DADS誘導(dǎo)HT-29細胞生長抑制相關(guān)基因的表達變化。結(jié)果:RNA提?。禾崛〉目俁NA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,可見明顯的三條(28S,18S和5S),未見RNA降解和DNA污染。提取的mRNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,呈“smear”帶,紫外分光檢測顯示提取的未處
8、理和處理的HT-29細胞polyA+RNA分別為1.2μg和1.5μg,吸光度A260/A280>1.90說明提取的mRNA質(zhì)量好,無DNA和RNA污染?! SH實驗:消減產(chǎn)物與未消減樣品(對照)的PCR結(jié)果在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上明顯不同,前者可見清浙的條帶,后者呈瀑布狀?! ∠麥p有效性實驗:用看家基因(G3PDH)特異的引物作PCR,未消減樣品在15次循環(huán)時即可見擴增產(chǎn)物。而消減產(chǎn)物在循環(huán)數(shù)達30次才見擴增產(chǎn)物,這說明本實驗的消
9、減有效性高?! 〔町愊麥pcDNA文庫的建立及鑒定:T/A克隆后,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌后,出現(xiàn)約500個白色克隆。隨機挑取100個白色克隆,提取質(zhì)粒DNA,EcoRI酶切、PCR分析發(fā)現(xiàn)73個克隆具有大小約100~1300bp的插入片段?! 》聪蛳麥p實驗:與上述SSH實驗相反,以誘導(dǎo)后結(jié)腸癌細胞提取的mRNA合成的cDNA作為驅(qū)趕子,誘導(dǎo)前癌細胞提取的mRNA合成的cDNA作為測試子,進行新一輪SSH,篩選出DADS誘導(dǎo)結(jié)
10、腸癌細胞前差異表達的基因。 測序及生物信息學(xué)分析:將73個PCR、酶切均為陽性的克隆送交測序,其中68個克隆基因序列完整;另有3個克隆的基因序列中部分堿基不能確定;2個克隆無測序結(jié)果,都被剔除。用生物信息學(xué)方法將得到的68個基因序列在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫進行同源性比較。結(jié)果顯示,68個克隆中有38個是已知基因序列,1個新的EST,這些已知基因序列的同源性在95%-100%。正向消減文庫中包括細胞代謝及抗氧化相關(guān)基因(SOD1、A
11、RPC3、MTO1、citratesynthase、DNCL1、HNRPAB、FTH1、SPINT2、UBA52);細胞周期及凋亡相關(guān)基因(p21、MRPS27、MM1、LGALS8);參與蛋白活化、降解或信號傳導(dǎo)的基因(TACSTD2、S100A6、PSMD12、GNB1、GPCR175、NSFL1C)。其它功能不詳?shù)幕驗镽ibosomalproteinS3、DPCD、LOC144501、MGC41816、RPL35A、HTDP1。
12、反向消減文庫中包括細胞代謝相關(guān)基因(TRIP13、TRA1);細胞周期及凋亡相關(guān)基因(PABPC1、YWHAE、RRM1);參與蛋白活化、降解或信號傳導(dǎo)的基因(ATP1A1、ATP6AP1、FLJ25150fis、RAC1);其它功能不詳?shù)幕驗镃LCP1、TMED5、KIAA0056protein、RPS6、Heatshockprotein8。這些基因中包括了幾十個以前在DADS的研究中從未涉及到的基因,生物信息學(xué)分析說明DADS在抗
13、結(jié)腸癌細胞生長過程中,不但有多種基因參與,而且還有一些我們尚不知道的基因也參與DADS的抗腫瘤應(yīng)答過程?! “攵縍T-PCR:從正、反向文庫中隨機挑取10個基因進行半定量RT-PCR分析,這些基因在處理組及未處理組HT-29細胞中的表達具有顯著性差異(P>0.05),與SSH分析一致,表明SSH是一種鑒定差異表達基因的強有力的方法,建立的兩個差異表達cDNA文庫代表DADS誘導(dǎo)結(jié)腸癌生長抑制相關(guān)基因真實可靠。結(jié)論:1.應(yīng)用SSH技術(shù)
14、成功構(gòu)建了DADS誘導(dǎo)HT-29細胞差異表達基因的正、反向cDNA庫。2.p21、MM1表達上調(diào),YWHAE、RRM1表達下調(diào)可能與DADS誘導(dǎo)HT-29細胞周期阻滯相關(guān)。3.TACSTD2、S100A6表達上調(diào),PABP表達下調(diào)可能與DADS誘導(dǎo)胞漿Ca2+富集,啟動癌細胞凋亡有關(guān)。4.SOD1、FTH1、DNCL1表達上調(diào)可能與DADS抗氧化效應(yīng)有關(guān)。5.SPINT2、galectins-8表達上調(diào),Rac1表達下調(diào)可能與抑制腫瘤細
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