乳酸桿菌表面活性片段通過表觀遺傳學調控腸上皮炎性細胞因子表達的機制研究.pdf

1、目的：
　　觀察MIMP對炎癥性腸病小鼠的腸道炎癥及腸道微生態(tài)的影響；探究MIMP對炎性細胞因子的作用效果和調節(jié)方式，并探討相關作用機制。
　　方法：
　　（1）將小鼠分為3組：DSS+MIMP組，DSS組和健康對照組。干預期間，觀察小鼠體重變化情況，腹瀉、血便、死亡等發(fā)生率，觀察各組小鼠腸道整體情況并制作H&E染色切片，觀察腸上皮組織病理學的改變；利用右旋糖苷異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocy

2、anate-dextran,FITC-Dextran）灌胃，檢測小鼠活體腸道通透性，并利用蛋白質印跡（Western blot）和實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)檢測各組小鼠腸道上皮中緊密連接蛋白（JAM-1,Occludin,ZO-1）的表達水平；利用qRT-PCR檢測各組小鼠腸道上皮中炎性細胞因子(IFN-γ,IL-17,IL-23,IL-4,IL-10）的表達,利用1

3、6SrRNA測序技術檢測各組小鼠腸道微生態(tài)的變化情況。
　?。?）利用類小腸上皮細胞的Caco-2細胞和外周血單核細胞（PBMCs）在Tranwells條件下建立共培養(yǎng)模型，利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作為炎癥刺激，利用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測MIMP在不同濃度及不同孵育時間下對腸道微環(huán)境中炎性細胞因子(IFN-γ,IL-17,IL-23,IL-4,IL-10）的調節(jié)情況。利用ELISA和q

4、RT-PCR檢測TLR4抑制劑對LPS介導的炎性細胞因子分泌水平的影響，并與MIMP的作用效果相互比較。利用Western blot檢測MIMP和TLR4抑制劑對MAPK及NF-κB通路的調節(jié)情況，并利用雙熒光素酶報告基因實驗檢測MIMP在不同濃度及不同孵育時間下對NF-κB活性影響的變化趨勢。
　?。?）利用Western blot檢測MIMP及TLR4抑制劑對由LPS介導的Caco-2細胞整體水平的組蛋白（H3,H4）乙?；?/p>

5、調節(jié)情況，利用染色質免疫共沉淀技術(ChIP)技術檢測MIMP在不同濃度及不同孵育時間下對具體水平的IL-17及IFN-γ上游啟動子區(qū)域組蛋白（H3,H4）乙酰化的調節(jié)情況；利用qRT-PCR檢測MIMP對LPS介導的組蛋白去乙?；?histone deaceylase,HDAC)表達水平的調節(jié)情況。
　　結果：
　　（1）與DSS組小鼠相比，MIMP+DSS組整體情況較好，體重減輕程度輕，腹瀉、便血及死亡發(fā)生率低，疾病活

6、動指數(shù)顯著下降；MIMP不但可以改善腸道整體情況，提高腸道長度(p<0.05)，還可有效提升組織學評分(p<0.001)；MIMP+DSS組血漿中 FITC-Dextran的含量顯著低于 DSS組(p<0.01)，而腸上皮中緊密連接蛋白（JAM-1,Occludin,ZO-1）的表達水平則顯著高于 DSS組(p<0.01)。此外，MIMP可降低腸道上皮中促炎性細胞因子（IFN-γ,IL-17,IL-23）的水平，并升高抑炎性細胞因子（I

7、L-4,IL-10）的水平。16SrRNA測序發(fā)現(xiàn)MIMP+DSS組較DSS腸道微生態(tài)多樣性顯著提升，shannon指數(shù)顯著降低(p<0.05),simpson指數(shù)存在一定上升趨勢(p=0.055)；主坐標分析(principal coordinate analysis, PCoA)提示三組小鼠腸道微生態(tài)在各分類學水平上存在明顯差異；樣本聚類樹與柱狀圖組合分析(The sample clustering tree and histogr

8、am analysis)提示MIMP+DSS組與健康對照組腸道微生態(tài)的相似程度更高；線性判別分析(LEfSe)分析顯示厚壁菌屬(Firmicute)是 DSS組小鼠腸道中的優(yōu)勢菌屬，明串珠菌屬(Leuconostocaceae)是DSS+MIMP組的優(yōu)勢菌屬，擬桿菌屬(Bacteroides)是健康對照組腸道中的優(yōu)勢菌屬。
　?。?）在共培養(yǎng)模型中，MIMP可扭轉因LPS引起的炎性細胞因子的分泌，降低促炎性細胞因子（IFN-γ,I

9、L-17,IL-23）的水平，升高抑炎性細胞因子（IL-4,IL-10）的水平；且 MIMP的調節(jié)存在一定的劑量與時間依賴性，在特定濃度和時間時(1ng/ml,12h)，MIMP的作用效應最為顯著；同時抑制性實驗證實MIMP與TLR4抑制劑具有相同的調節(jié)炎性細胞因子的能力；此外，MIMP和TLR4抑制劑均可有效
　　阻斷MAPK及NF-κB通路激活，且隨著MIMP劑量的提高和時間的延長，NF-κB的活性也呈現(xiàn)階梯狀下降趨勢。

10、>　?。?）LPS可使得組蛋白（H3,H4）整體水平的乙?；潭忍岣?，而 MIMP與 TLR4抑制劑干預可有效降低其乙酰化程度，并存在劑量依賴性；在具體水平中，隨著劑量的提高和時間的延長，MIMP可有效降低IL-17和IFN-γ上游啟動子區(qū)域組蛋白（H3,H4）的乙?；潭?；同時，MIMP還可以顯著上調部分HDAC的表達。
　　結論：
　　MIMP可有效改善IBD小鼠的炎癥狀態(tài)及腸屏障功能，顯著下調促炎性細胞因子的表達，上調