NF-κB在葡萄膜鞏膜房水外流通道的表達(dá)及其作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、青光眼目前已成為世界范圍內(nèi)第二位不可逆致盲性眼病。研究青光眼的多中心臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果表明，個(gè)體化眼壓正常調(diào)控治療仍然是目前阻止病程進(jìn)展的最有效手段。臨床上青光眼眼壓升高絕大部分是因房水外流阻力增加所致。葡萄膜鞏膜房水流出途徑是房水的兩條重要排出途徑之一，因此，研究葡萄膜鞏膜房水流出通道的分子調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步了解青光眼的發(fā)病機(jī)理，豐富青光眼房水流出作用機(jī)制理論，為青光眼的治療提供新的、強(qiáng)有力的手段。 研究目的：觀察曲伏前列腺素

2、藥物作用下，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及IκB系統(tǒng)對(duì)葡萄膜鞏膜房水外流的分子調(diào)控，以及MMP-2在葡萄膜鞏膜房水外流通道的作用，力圖闡明葡萄膜鞏膜房水外流的分子機(jī)制。 研究方法： 1、體外培養(yǎng)人睫狀肌細(xì)胞并鑒定。 2、人睫狀肌細(xì)胞培養(yǎng)基中加1μM曲伏前列腺素，根據(jù)孵育時(shí)間的不同分為4組，即0hr組(對(duì)照組)、6hr組、12hr、24hr組。孵育至上述時(shí)間點(diǎn)時(shí)，分別收取細(xì)胞孵育液及細(xì)胞，real-timeRT-PCR、和

3、免疫熒光半定量分析分別檢測(cè)上述時(shí)間組NF-κBp65、IκBα、MMP-2在基因和蛋白水平的表達(dá)。Zymography技術(shù)測(cè)定MMP-2活性。 研究結(jié)果： 1、人睫狀肌細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 1.1光鏡組織塊培養(yǎng)的睫狀肌細(xì)胞，1周后細(xì)胞開始從組織塊周邊游離出來，呈典型的梭形。組織塊培養(yǎng)細(xì)胞融合后，組織塊周圍細(xì)胞呈漩渦狀排列，組織塊間細(xì)胞呈峰谷樣排列。 1.2細(xì)胞用Smoothmuscleα-actin和Desmi

4、n免疫熒光反應(yīng)均可見陽性物質(zhì)分布于胞漿中。形態(tài)學(xué)和免疫熒光鑒定證明所培養(yǎng)的細(xì)胞是人睫狀肌細(xì)胞。 2、real-timeRT-PCR法分別檢測(cè)NF-κBp65、IκBα、MMP-2在不同時(shí)間組的基因表達(dá) mRNA相對(duì)定量結(jié)果用LSD-t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析顯示與對(duì)照組比較6hr、12hr、24hr組NF-κBp65均表達(dá)下降(p=0.001)；IκBα熒光強(qiáng)度6hr組、12hr組較對(duì)照組改變不明顯(p＞0.05)，24hr組較對(duì)照

5、組增加(p=0.000)；MMP-2基因表達(dá)6hr組較對(duì)照組下降(p=0.000)，12hr、24hr組較對(duì)照組逐漸增加趨勢(shì)(p=0.000)。 3、免疫熒光半定量分析 相同曝光時(shí)間、相同面積下對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞熒光染色強(qiáng)度應(yīng)用LSD-ttest統(tǒng)計(jì)軟件分析表明：NF-κBp65熒光強(qiáng)度6hr、12hr、24hr組均較對(duì)照組減少(p=0.000)；Iκ±Bα6hr組較對(duì)照組沒有明顯改變(p=0.134)、12hr組較

6、對(duì)照組輕微下降(p=0.032)，24hr組較對(duì)照組明顯增加(p=0.001)；MMP-2熒光強(qiáng)度6hr組較對(duì)照組熒光強(qiáng)度減少(p=0.305)，12hr、24hr組較對(duì)照組逐漸升高趨勢(shì)(p=0.000)。 4、Zymography(明膠酶譜)技術(shù)檢測(cè)各時(shí)間組MMP-2的活性 Zymography凝膠中可見一條MMP-2透明條帶，分子量為72kDa，對(duì)照組與6hr、12hr、24hr組MMP-2校正光密度值分別為10.2