定量組織速度及應(yīng)變率成像評(píng)價(jià)心肌缺血再灌注心功能與細(xì)胞凋亡、核因子（NF-κB）的相關(guān)性研究.pdf

1、本研究采用定量組織速度及應(yīng)變率成像觀察犬心肌缺血再灌注后局部心肌收縮功能和左室整體收縮功能，應(yīng)用特異性NF-KB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyorrole dithitocarbamate，PDTC)研究其對心肌缺血再灌注損傷的影響，探討其在缺血再灌注細(xì)胞凋亡過程中的作用，并探討細(xì)胞凋亡與心功能的關(guān)系，以期從基因水平為防治缺血性心肌損傷探索一種新途經(jīng)。 方法： 第一部分： 將30只犬隨機(jī)分為三組：對照組(Con

2、組，n=10)，：僅于LAD下穿線，不結(jié)扎；缺血再灌注組(IR組，n=10)：單純阻斷LAD 30 min，再灌注120 min。二硫代氨基甲酸吡咯烷組(PDTC組，n=10)：阻斷LAD前經(jīng)靜脈給予PDTC(100mg/kg)，其余步驟同IR組。實(shí)驗(yàn)犬分別于缺血前、缺血30min、再灌注即刻及再灌注120 min時(shí)行以下各項(xiàng)檢查。 定量組織速度及應(yīng)變率檢測方法：分別取三組犬心尖四腔、兩腔和左室長軸切面，待圖像調(diào)整滿意后轉(zhuǎn)換成T

3、VI(tissue velocity imaging)程序，連續(xù)記錄至少三個(gè)完整心動(dòng)周期的動(dòng)態(tài)組織速度圖像儲(chǔ)存待分析。心肌大體病理檢測：將LAD重新結(jié)扎，伊文思藍(lán)及氯化三苯四氮唑(TTC)溶液染色顯示缺血心肌，立即對切片拍照待分析。 心肌組織特染(蘇木素堿性復(fù)紅苦味酸染色)：取出左室前壁心肌組織，甲醛固定，石蠟切片，用明礬蘇木素及堿性復(fù)紅染色，用苦味酸丙酮液分化，二甲苯透明，樹膠封固。 心肌組織透射電鏡檢查：取左室前壁心

4、肌組織，大小約1mm<'3>，2.5％戊二醛溶液固定，常規(guī)電鏡切片，采用透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。 第二部分： 凋亡細(xì)胞檢測：采用原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的熒光素脫氧尿嘧啶核苷酸缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)。取三組缺血區(qū)心肌組織，石蠟切片4-6μm，采用Roche公司檢測試劑盒進(jìn)行凋亡細(xì)胞檢測，計(jì)算陽性細(xì)胞指數(shù)。 心肌總RNA的提取及半定量RT-PCR檢測caspase-3 mRNA的表達(dá)：取三組缺血區(qū)心肌各

5、100 mg剪碎，用Trizol 1000μl勻漿、抽提組織總RNA，核酸測定儀檢測總RNA濃度，A260/280為1.8～2.0。應(yīng)用RT-PCR法檢測caspase-3 mRNA的表達(dá)。引物設(shè)計(jì)如下： caspase-3(176bp)：上游5’-CATGGCCTGTCAGAAAATAC-3’，下游5’-TAACCCGAGTAAGAATGTGC-3’，內(nèi)參GAPDH(194bp)：上游5’-GGAGAAAGCTGCCAAATATG-3

6、’，下游5’-ACCAGGAAATGAGCTTGACA-3’。反應(yīng)體系：10×Buffer(各10mM)2.5μl，Rnase抑制劑(40u/μl)0.5μl，MgCl<,2> 5.0μl，AMV Rtase(5μ/μl)0.5μl，AMV-Optimizard Taq(5μ/μl)0.5μl，GAPDH上游引物(10pmol)0.5μl/．GAPDH下游引物(10pmol)0.5μl，CASPASE上游引物(20pmol)0.5μl，

7、CASPASE下游引物(20pmol)0.5μl。反應(yīng)條件：變性94℃ 60 S，退火56℃ 60 S，延伸72℃2 min，延伸30個(gè)循環(huán)，終延伸72℃ 7 min。反應(yīng)產(chǎn)物用4％瓊脂糖凝膠電泳(100V，40 min)，紫外燈下觀察結(jié)果并攝片，凝膠成像系統(tǒng)(Labwork 3.0)軟件分析進(jìn)行圖像分析，以caspase-3與GAPDH擴(kuò)增條帶的輝度值比值來評(píng)定caspase3 mRNA表達(dá)水平。 蛋白印跡分析(western

8、-blot)定量檢測NF-kB的表達(dá)：行核蛋白提取，F(xiàn)orlin-酚蛋白定量法行蛋白濃度測定。取50μg核蛋白行10％SDS-PAGE蛋白電泳并將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上，轉(zhuǎn)移后的NC膜于封閉液中37℃封閉2h，一抗為兔抗犬NF-kB抗體(1：200)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)化的羊抗兔抗體(1：10000)，最后通過DAB顯色。計(jì)算機(jī)掃描，采用圖象分析軟件(Lab-work3.0)比較目的條帶吸光度值(AValue)。免疫組化法測caspase

9、-3蛋白的表達(dá)：將待檢心肌標(biāo)本用10％中性甲醛液固定。石蠟切片4-6μm，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原活性，血清封閉，滴加1：200抗犬caspase-3抗體，4℃孵育過夜。滴加熒光素化相應(yīng)二抗，加鏈霉素一熒光素一過氧化物酶復(fù)合物，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。光鏡下計(jì)算陽性細(xì)胞指數(shù)。 免疫組化法測NF-kB蛋白的表達(dá)：將待檢心肌標(biāo)本用10％中性緩沖甲醛液固定，石蠟切片4-6μm。滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原活性，血清

10、封閉，滴加1：200抗犬NF-kBp65抗體，4℃孵育過夜。滴加相應(yīng)二抗，加鏈霉素一熒光素一過氧化物酶復(fù)合物，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。光鏡下計(jì)算陽性細(xì)胞指數(shù)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 第一部分： 1．缺血前基礎(chǔ)狀態(tài)，三組犬左室前壁增厚率無明顯差異。IR組與PDTC組冠脈結(jié)扎即刻前壁增厚率明顯低于Con組。冠脈結(jié)扎后30 min，左室前壁增厚率進(jìn)一步下降。再灌注120 min后，左室前壁增厚率幾乎接近缺血前。 2．缺

11、血30 min EF無顯著下降，再灌注即刻EF下降，以后EF逐漸恢復(fù)，至再灌注120min，PDTC組EF幾乎接近缺血前，與IR組比較有顯著差異。 3．缺血30 min時(shí)Vs峰值較閉塞前明顯降低、后移。IR組與PDTC組均觀察到PSS。再灌注120 min時(shí)PDTC組Vs測值較同一時(shí)點(diǎn)IR組Vs高；此時(shí)PSS節(jié)段數(shù)也少于IR組。 4．缺血30．min時(shí)SR<,s>較閉塞前明顯降低。IR組與PDTC組均觀察到PSS。再灌注

12、120 min后PDTC組SR<,s>測值較同一時(shí)點(diǎn)IR組SR<,s>高；此時(shí)：PSS節(jié)段數(shù)也少于IR組。 5．缺血前Con組、IR組及PDTC組左室整體收縮功能EF與左室前壁應(yīng)變率均呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r<,Con>=-0.88，r<,IR>=-0.73，r<,PDTC>=-0.69。 第二部分： 1、IR組缺血區(qū)TUNEL凋亡指數(shù)與Con組比較有顯著性差異；PDTC組心肌TUNEL凋亡指數(shù)較Con組雖

13、仍有顯著性差異，但與IR組比較已明顯減少。 2、IR組caspase-3 mRNA表達(dá)高于對照組，而：PDTC組表達(dá)明顯低于IR組。 3、與Con組比較IR組caspase-3陽性細(xì)胞指數(shù)明顯增加，而PDTC組的陽性細(xì)胞指數(shù)與Con組比較差異仍有顯著意義，但PDTC組與IR組比較已明顯減少。 4、IR組核蛋白NF-kB表達(dá)增加；PDTC組NF-kB表達(dá)量明顯減少。 5、與Con組比較IR組NF-kB陽性細(xì)

14、胞指數(shù)明顯增加，而PDTC組的陽性細(xì)胞指數(shù)與Con組比較差異仍有顯著意義，但PDTC組與IR組比較已明顯減少。 6、Con組、IR組及PDTC組左室前壁局部收縮功能SR與TUNEL陽性細(xì)胞指數(shù)均呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r<,Con>=0.92，r<,IR>=0.69，r<,PDTC>=0.94。 結(jié)論： 1、TVI及SR技術(shù)可以準(zhǔn)確、定量評(píng)價(jià)局部心肌收縮功能變化，且SR評(píng)價(jià)左室收縮功能與EF有良好的相關(guān)性。