實時熒光PCR檢測臨床真菌方法的建立及其臨床應用.pdf

1、目的：建立臨床病原真菌的實時熒光PCR檢測方法，評價其檢測臨床標本真菌感染的應用價值。 方法：酚-異硫酸氰胍法提取5例臨床培養(yǎng)陽性病原真菌的DNA，利用與真菌核糖體的18SrDNA互補的一對通用引物，優(yōu)化實驗條件，建立SYBR Green I實時熒光PCR檢測病原真菌的方法，應用建立的提取真菌DNA和實時熒光PCR方法檢測了37例臨床標本，通過對比傳統(tǒng)鑒定方法，評價其檢出真菌感染的有效性。 結果：通過酚-異硫酸氰胍法提取

2、的病原真菌DNA在純度和質(zhì)量上都符合PCR的實驗要求，且整個提取過程經(jīng)優(yōu)化后在1小時內(nèi)完成；建立的實時熒光PCR方法擴增曲線形態(tài)良好，無非特異性擴增，標準曲線相關系數(shù)達到1.O，檢測靈敏度達到20pg DNA，5例臨床培養(yǎng)陽性真菌菌株均能被檢出，且念珠菌和絲狀真菌具有不同的Tm值，據(jù)此可以初步鑒別。37例臨床標本直接鏡檢共有9例陽性，均為角膜標本，普通培養(yǎng)法共培養(yǎng)到12例陽性，包括鏡檢陽性的9例角膜標本，其余3例為深部真菌病患者組織，實