中藥誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合去抗原牛松質(zhì)骨修復(fù)兔橈骨缺損試驗(yàn)研究.pdf

1、目的：接骨中藥已廣泛應(yīng)用于臨床，臨床觀察發(fā)現(xiàn)接骨中藥能構(gòu)促進(jìn)骨折及骨缺損愈合。本試驗(yàn)通過(guò)中藥血清藥理學(xué)方法，進(jìn)行復(fù)方接骨中藥含藥血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）復(fù)合去抗原牛松質(zhì)骨載體（BCB）修復(fù)兔橈骨缺損的研究，旨在從細(xì)胞水平上探討復(fù)方中藥促進(jìn)骨缺損修復(fù)的作用機(jī)制。
　　 方法：傳統(tǒng)復(fù)方接骨中藥由厚樸、大黃、枳殼、桃仁、蘇木、當(dāng)歸、紅花、骨碎補(bǔ)、川斷、龜板等組成。按體表面積計(jì)算等效劑量，以中醫(yī)方法煎制后灌喂飼養(yǎng)試驗(yàn)組動(dòng)

2、物，對(duì)照組則用等量自來(lái)水灌喂。同種條件下喂養(yǎng)10d后，采集各組動(dòng)物股動(dòng)脈血4ml并于無(wú)菌離心管中室溫下離心，提取血清并滅活補(bǔ)體，制備含藥及對(duì)照血清。于無(wú)菌條件下在新西蘭兔雙側(cè)坐骨棘處用骨髓穿刺針抽吸骨髓液，以無(wú)菌培養(yǎng)皿收集骨髓，而后用注射器反復(fù)抽吸，使之成為細(xì)胞懸液。收集并離心細(xì)胞懸液，在37℃、5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3代以后的細(xì)胞用于試驗(yàn)。試驗(yàn)組細(xì)胞用10％含藥血清+DMEM培養(yǎng)，對(duì)照組細(xì)胞用10％非含藥血清+DMEM培養(yǎng)

3、，每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，麥胚凝集沉淀法測(cè)定骨源性堿性磷酸酶（BALP）活性。
　　 將含藥及不含藥血清培養(yǎng)誘導(dǎo)分化2周的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）種植于預(yù)濕的去抗原牛松質(zhì)骨載體上，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h，待細(xì)胞基本貼壁后，取4月齡新西蘭兔24只，隨機(jī)分為兩組，每組12只。每只兔一側(cè)前肢截取中段1.2cm橈骨，造成骨缺損。試驗(yàn)組于骨缺損處植入中藥誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與

4、去抗原牛松質(zhì)骨復(fù)合物，對(duì)照組于骨缺損處植入非中藥誘導(dǎo)的細(xì)胞和去抗原牛松質(zhì)骨。分別于術(shù)后3、6、12周收集植骨標(biāo)本，經(jīng)大體觀察及攝X線片后將各組標(biāo)本保留于10％中性福爾馬林中，經(jīng)石蠟包埋后切片并行HE染色，光鏡下觀察骨缺損修復(fù)及成骨的組織學(xué)變化。測(cè)定6，12周標(biāo)本植入?yún)^(qū)中部骨密度，并與對(duì)側(cè)正常骨比較。
　　 結(jié)果：試驗(yàn)組與對(duì)照組的組織學(xué)變化明顯不同。經(jīng)中藥血清誘導(dǎo)后的骨髓MSC數(shù)量多，細(xì)胞核較大并呈扁圓形，染成藍(lán)色，細(xì)胞排列呈成纖

5、維細(xì)胞樣，植入載體內(nèi)有新骨形成。對(duì)照組細(xì)胞體積較大，成梭形，個(gè)別細(xì)胞呈三角形或多角形，載體骨小梁間隙可見(jiàn)纖維組織，未見(jiàn)新骨形成，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明BALP活性明顯高于對(duì)照組。
　　 用體積分?jǐn)?shù)為0.1含藥血清+DMEM培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)第1周末，增殖細(xì)胞呈簇集生長(zhǎng)，以培養(yǎng)孔的周緣最為明顯，細(xì)胞形態(tài)以梭形為主；培養(yǎng)第2周末，細(xì)胞大量增殖，密度增高，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變化，由單一的梭形纖維狀變成較多量的三角形、多角形、立方形細(xì)胞，完全具

6、備成骨細(xì)胞形態(tài)。此時(shí)測(cè)定骨堿性磷酸酶活力達(dá)到高峰，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已大量誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。培養(yǎng)孔內(nèi)成骨細(xì)胞貼附成星形，突起向孔隙壁延伸。培養(yǎng)孔周緣的細(xì)胞已連接成片，形成細(xì)胞重疊，細(xì)胞分泌旺盛，胞體豐滿，胞漿透明清晰，貼壁牢固，細(xì)胞突起增多，胞體間緊密連接，細(xì)胞之間界限模糊，以后細(xì)胞生長(zhǎng)情況變化不大。對(duì)照組誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)組相似，但成骨細(xì)胞數(shù)量、密度明顯較實(shí)驗(yàn)組下降，同期細(xì)胞骨堿性磷酸酶活力較實(shí)驗(yàn)組低，同期細(xì)胞BA

7、LP活性較低。
　　 經(jīng)四唑鹽法證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞均先進(jìn)入生長(zhǎng)緩慢的滯留階段，為潛伏期，該期約在傳代后1－2d，此時(shí)兩組比較差異無(wú)顯著性（P>0.05）。以后進(jìn)入迅速增殖的指數(shù)生長(zhǎng)期（該期在傳代后3－5d），在3d、4d、5d時(shí)進(jìn)行四唑鹽試驗(yàn)證明實(shí)驗(yàn)組均比對(duì)照組增殖迅速（P<0.05，P<0.01，P<0.01），5d后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組達(dá)到生長(zhǎng)停止的平臺(tái)期。
　　 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均是在第2周末時(shí)骨堿性磷酸酶活力達(dá)到高

8、峰，第3周末開(kāi)始明顯下降，在第1和4周末時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性（P>0.05），在第2，3周末時(shí)實(shí)驗(yàn)組骨堿性磷酸酶活力均大于對(duì)照組（P<0.05）。
　　 大體觀察及X線片顯示：試驗(yàn)組骨痂生長(zhǎng)良好，骨缺損修復(fù)完成；對(duì)照組骨缺損部分修復(fù)，部分為骨不連接。試驗(yàn)組骨密度測(cè)定實(shí)驗(yàn)組的骨密度均顯著高于對(duì)照組的骨密度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 1.復(fù)方接骨中藥可促進(jìn)體外培養(yǎng)的骨髓MSC