放射啟動(dòng)MIP-3α基因激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答的研究.pdf

1、肺癌是發(fā)病率高、預(yù)后差的惡性腫瘤之一,近年來(lái),其發(fā)病率和病死率在中國(guó)呈上升趨勢(shì).以手術(shù)、化療、放療為主的綜合治療是肺癌的主要治療方法,但療效尚不理想,目前肺癌患者總的5年生存率仍低于15﹪.因此亟待尋找治療肺癌的更為有效的手段.生物治療是繼手術(shù)、放療及化療之后興起的一種新的治療肺癌的方法,被認(rèn)為是目前治療肺癌極有前景的治療手段.大量研究證明,有效的抗腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)的核心是產(chǎn)生CD8+的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T Lym

2、phocyte,CTL).利用CTL對(duì)腫瘤進(jìn)行特異性殺傷,已經(jīng)成為治療惡性腫瘤的有力手段之一.現(xiàn)已明確,有效活化CTL反應(yīng)關(guān)鍵是抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)能否將"第一信號(hào)"(抗原信號(hào))和"第二信號(hào)"(共刺激信號(hào))有效的傳遞給初始型T細(xì)胞.在所有的抗原遞呈細(xì)胞中,功能最強(qiáng)大的則是樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC),它表達(dá)高水平MHC分子、共刺激分子;能夠吞噬處理凋亡或壞死腫瘤細(xì)胞等

3、顆粒性抗原,具有"交叉遞呈(cross-presentation)"外源性抗原的能力;也是機(jī)體有效激發(fā)CTL反應(yīng)的樞紐.以往的研究證明:DC在體外能夠高效吞噬腫瘤細(xì)胞的凋亡小體,獲取抗原,從而誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng).隨著DC體外分離、培養(yǎng)技術(shù)的成熟,各種以DC為基礎(chǔ)的疫苗也應(yīng)運(yùn)而生,并在部分惡性腫瘤的治療中取得了令人振奮的效果.然而,所有以DC為基礎(chǔ)的疫苗制備必需經(jīng)過(guò)DC的體外分離、培養(yǎng)、負(fù)載、成熟等步驟,這一臨床操作過(guò)程繁瑣,而且費(fèi)用高

4、.因此,尋找一種操作簡(jiǎn)便以樹(shù)突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療策略迫在眉睫.目前已經(jīng)證實(shí),DC存在于體內(nèi)多種組織中,如外周血單核細(xì)胞(PBMC)中有1﹪的細(xì)胞為DC,皮膚中也有DC的存在,即郎罕細(xì)胞.因此,可以通過(guò)趨化作用使體內(nèi)DC向腫瘤局部募集而增加DC的數(shù)量.近期的研究表明,多種趨化因子,如巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-3α (macrophage inflammatory protein-3α,MIP-3α)、RANTES、MIP-1β和SDF-1等,

5、在體內(nèi)、外對(duì)DC均有趨化作用.其中,MIP-3α是一種對(duì)未成熟DC有強(qiáng)烈的趨化作用,而對(duì)成熟DC卻無(wú)趨化作用的趨化因子.因此,我們?cè)O(shè)想:利用MIP-3α對(duì)未成熟DC的強(qiáng)烈趨化特性,將腫瘤周?chē)M織,甚至遠(yuǎn)處的DC趨化到腫瘤局部,遞呈腫瘤來(lái)源的外源性抗原,進(jìn)而激發(fā)機(jī)體特異性抗瘤免疫應(yīng)答.然而,這種設(shè)想的局限性是難于在體內(nèi)有效活化CTL反應(yīng).其主要原因有以下兩點(diǎn):①DC只能吞噬凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞(即顆粒性抗原),難于有效吞噬正常的腫瘤細(xì)胞,

6、因而無(wú)法實(shí)現(xiàn)"交叉遞呈"腫瘤抗原的過(guò)程;②DC在吞噬外源性抗原后,必須經(jīng)IL-1β、TNF-α等"危險(xiǎn)信號(hào)(danger signal)"的刺激才能活化、成熟,而腫瘤局部缺乏上述"危險(xiǎn)信號(hào)",且未成熟的DC不但不能有效激發(fā)CTL反應(yīng),反而會(huì)加重機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受.放療是肺癌的主要治療方法之一,它引起腫瘤細(xì)胞死亡的最主要方式是細(xì)胞凋亡或壞死.放療本身可以起到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的,又能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死,為DC提供有效的外源性抗原(

7、凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞);還通過(guò)誘導(dǎo)免疫刺激因子的分泌,為DC提供成熟、活化必需的"危險(xiǎn)信號(hào)"(IL-1β、TNF-α等免疫刺激細(xì)胞因子)微環(huán)境.基于上述認(rèn)識(shí),我們?cè)O(shè)想:若能將局部放療結(jié)合MIP-3α基因治療,MIP-3α可將DC募集至腫瘤組織,放療不但可殺傷腫瘤細(xì)胞,還可提供DC"交叉激活"CTL反應(yīng)所必需的條件.此外,放療既可以對(duì)MIP-3α基因表達(dá)進(jìn)行空間上的調(diào)控,使MIP-3α集中在腫瘤局部表達(dá),從而吸引DCs高效聚集; 還可以進(jìn)

8、行時(shí)間上的調(diào)控,以避免MIP-3α的持續(xù)表達(dá),而造成體內(nèi)DC的無(wú)效消耗. 近年來(lái)活躍在基因治療領(lǐng)域的早期生長(zhǎng)反應(yīng)-1基因(early growth response-1, Egr-1)啟動(dòng)子是我們對(duì)MIP-3α基因進(jìn)行時(shí)間和空間上的調(diào)控的良好工具.Egr-1基因?yàn)榧纯淘缙诨?immediate early genes, IEGs)家族成員,是一種含有3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子.該轉(zhuǎn)錄因子可在輻射、缺氧等應(yīng)激條件下被活化,通過(guò)與DNA序列上

9、的順式作用元件結(jié)合,進(jìn)而誘導(dǎo)目的基因表達(dá).Egr-1基因的5'端上游啟動(dòng)子區(qū)域含有3個(gè)Egr-1的結(jié)合元件和CarG盒,應(yīng)激條件可通過(guò)誘導(dǎo)Egr-1、c-fos、c-jun等即刻早期基因的表達(dá),使Egr-1基因的表達(dá)在體內(nèi)呈逐級(jí)放大趨勢(shì).根據(jù)Egr-1在應(yīng)激條件下表達(dá)的上述特性,有研究者設(shè)計(jì)用Egr-1啟動(dòng)子啟動(dòng)的TNF-α基因的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行放療增敏實(shí)驗(yàn),稱(chēng)為放射-基因治療,取得了可喜的苗頭.該研究基于DC在抗瘤免疫應(yīng)答中的重要性和目前

10、DC疫苗的缺陷,提出利用Egr-1啟動(dòng)子的局部放療的反應(yīng),對(duì)MIP-3α基因表達(dá)的進(jìn)行時(shí)空調(diào)控,激發(fā)機(jī)體抗瘤免疫應(yīng)答的新設(shè)想.這種設(shè)想的工作原理如下:通過(guò)放療誘導(dǎo)腫瘤局部DC趨化因子(MIP-3α)的表達(dá),在MIP-3α的作用下,DCs向照射局部聚集,處理放療后凋亡或壞死腫瘤細(xì)胞來(lái)源的腫瘤抗原,并在放療局部存在的多種免疫刺激因子的作用下成熟、活化,從而"交叉激活"CTL反應(yīng).該設(shè)想一方面利用Egr-1啟動(dòng)下游基因表達(dá)具有超強(qiáng)而短暫的特性

11、,使MIP-3α的表達(dá)隨放射誘導(dǎo)按需開(kāi)關(guān),實(shí)現(xiàn)對(duì)MIP-3α基因表達(dá)調(diào)控,從而更有效的激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗瘤免疫應(yīng)答;另一方面,該研究有別于以往在Egr-1下游引入的目的基因是具備直接的腫瘤殺傷效應(yīng)的"治療性基因",而是引入了在表達(dá)后可以引發(fā)一些后續(xù)的抗腫瘤免疫效應(yīng)的"誘導(dǎo)性基因",使目的基因起到"放大器"的作用,對(duì)于探討放射-基因治療的靶基因的選擇,也是一種新的思路.基于以上設(shè)想,該研究擬將MIP-3α基因串聯(lián)到Eg-1啟動(dòng)子下游,構(gòu)建Eg

12、r-1啟動(dòng)的MIP-3α質(zhì)粒載體,用其轉(zhuǎn)染Lewis肺癌細(xì)胞,并進(jìn)行放射誘導(dǎo),通過(guò)體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn),觀察MIP-3α表達(dá)情況,對(duì)DC的趨動(dòng)情況及對(duì)腫瘤治療的效應(yīng).該研究有機(jī)結(jié)合了放射治療、免疫治療和基因治療于一體,對(duì)實(shí)驗(yàn)性肺癌的治療進(jìn)行了全新的嘗試.第一部分 Egr-1為啟動(dòng)子的MIP-3α表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 材料及方法:以限制內(nèi)切酶XbaⅠ+NcoⅠ雙酶切p-Egr質(zhì)粒,切去CAT基因,0.6﹪瓊脂糖凝膠電泳,用瓊脂糖凝膠回收試劑盒提

13、取純化,獲得含Egr-1啟動(dòng)子線(xiàn)性化載體,備用.以pCMV-MIP3α質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增MIP-3α片段.用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物,并在上、下游引物中分別加入XbaⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn).用XbaⅠ+NcoⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物.用T4 DNA連接酶將上述線(xiàn)性化載體和PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng),得到重組質(zhì)粒pEgr-1-MIP-3α,記為pEgr-MIP3α.以XbaⅠ+NcoⅠ酶切重組質(zhì)粒中的MIP-3α序列,并由上

14、海Seagon公司進(jìn)行測(cè)序.用堿裂解法及聚乙二醇沉淀純化法大量制備并純化重組質(zhì)粒.結(jié)果:獲得重組質(zhì)粒pEgr-MIP3α,經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序鑒定,確認(rèn)MIP-3α序列插入正確.大量制備及純化了后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需的重組質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒.第二部分 放射誘導(dǎo)Egr-1啟動(dòng)子調(diào)控的MIP-3α基因在Lewis肺癌細(xì)胞中的表達(dá) 材料及方法:用DOTAP脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pEgr-MIP3α轉(zhuǎn)染Lewis肺癌細(xì)胞,以pEgr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染為對(duì)照,16h后以電子線(xiàn)6

15、Mev分別以2、4、6、8和10Gy和假照射(0Gy)照射.照后24h收集培養(yǎng)上清及細(xì)胞.用RT-PCR檢測(cè)LLC MIP-3α mRNA表達(dá),經(jīng)Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MIP-3α蛋白表達(dá),ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清內(nèi)分泌型MIP-3α水平.結(jié)果:證實(shí)MIP-3α在LLC中有少量表達(dá).對(duì)照質(zhì)粒pEgr轉(zhuǎn)染的LLC經(jīng)10Gy放療后,MIP-3α表達(dá)無(wú)增高.經(jīng)重組質(zhì)粒pEgr-MIP3α轉(zhuǎn)染的LLC,經(jīng)2-10Gy電子線(xiàn)放射后,

16、MIP-3α表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)染者及轉(zhuǎn)染后未照射(0Gy)者. MIP-3α表達(dá)與放射劑量成正比.第三部分 放射啟動(dòng)MIP-3α基因治療小鼠Lewis肺癌移植瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究 材料與方法:建立Lewis肺癌的C57BL/6J小鼠移植瘤皮下模型,待腫瘤長(zhǎng)至1cm3左右時(shí) (15天左右),將荷瘤鼠隨機(jī)分為6組(n=8):(1)空質(zhì)粒p-Egr對(duì)照組,(2)單純放射治療組,(3)對(duì)照質(zhì)粒pCMV-MIP3α注射組,(4)對(duì)照質(zhì)粒pCMV-MI

17、P3α注射+放療組,(5)pEgr-MIP3α質(zhì)粒注射組,(6)pEgr-MIP3α質(zhì)粒注射+放療組.用裸質(zhì)粒靜脈高容量基因治療方法,將質(zhì)粒50μg溶于1.6ml-2.2ml生理鹽水中,經(jīng)小鼠尾靜脈快速注射,在7s內(nèi)完成.放療組和質(zhì)粒+放療組于注射治療后8小時(shí)進(jìn)行10Gy放療,放療后24小時(shí)處死每組小鼠各2支,取小鼠肝、肺、腫瘤組織提取總RNA,行RT-PCR觀察組織中MIP-3α表達(dá)情況.第3天處死每組小鼠各2只,取腫瘤組織行免疫組化

18、檢測(cè)DC(CD11c+細(xì)胞)及CD8+、CD4+細(xì)胞以觀察腫瘤組織中DC浸潤(rùn)和CTL浸潤(rùn)情況.兩批小鼠處死時(shí)均收集血清行ELISA檢測(cè)血清MIP-3α水平.余下小鼠進(jìn)一步觀察腫瘤生長(zhǎng)速度.結(jié)果:空質(zhì)粒對(duì)照組和單純放射組中,MIP-3α mRNA在荷瘤小鼠肝、肺及腫瘤組織中均有少量表達(dá),血清中MIP-3α水平很低,腫瘤組織中無(wú)明顯DCs和CD8+細(xì)胞浸潤(rùn).對(duì)照質(zhì)粒pCMV-MIP3α注射組中,小鼠在注射質(zhì)粒后32小時(shí),小鼠血清內(nèi)MIP-3

19、α水平顯著上升,小鼠肝、肺及腫瘤組織中MIP-3α mRNA表達(dá)量均增高,其中以肝臟最為顯著,腫瘤組織內(nèi)MIP-3α水平與肺相當(dāng);第3天,血清內(nèi)MIP-3α水平降低,但仍高于空質(zhì)粒對(duì)照和單純放療組,但腫瘤組織內(nèi)DCs和 CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)與空質(zhì)粒對(duì)照和單純放療組無(wú)明顯差別.對(duì)照質(zhì)粒pCMV-MIP3α注射+放療組中,放射后MIP-3α mRNA表達(dá)和血清MIP-3α水平較均空質(zhì)粒對(duì)照和單純放射組增高,較單純pCMV-MIP3α質(zhì)粒注射組無(wú)

20、增高,DCs和CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)較空質(zhì)粒組、單純放療組和對(duì)照質(zhì)粒注射組無(wú)差異.重組質(zhì)粒pEgr-MIP3α注射組MIP-3α mRNA表達(dá)和血清MIP-3α水平與空質(zhì)粒對(duì)照組和單純放療組無(wú)明顯差別,且低于對(duì)照質(zhì)粒注射組及對(duì)照質(zhì)粒注射+放療組,腫瘤組織內(nèi)DCs和CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)情況與前4組亦無(wú)明顯差別.重組質(zhì)粒pEgr-MIP3α注射+放療組,放療后腫瘤組織MIP-3α mRNA表達(dá)和血清MIP-3α水平,瘤內(nèi)DCs和CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)均較空

21、質(zhì)粒組、單純放射組、對(duì)照質(zhì)粒注射組、對(duì)照質(zhì)粒注射+放療和pEgr-MIP3α注射組增高.對(duì)比各組在放射治療后第15天腫瘤大小,空質(zhì)粒pEgr注射組、對(duì)照質(zhì)粒pCMV-MIP3α注射組和重組質(zhì)粒pEgr-MIP3α注射組腫塊明顯大于其他各組,單純放療和pCMV-MIP3α注射+放療組較小,pEgr-MIP3α注射+放療組腫瘤最小(P<0.05).全文小結(jié) 1.用定向克隆的方法成功構(gòu)建了Egr-1啟動(dòng)子調(diào)控的MIP-3α基因的重組質(zhì)粒載體p

22、Egr-MIP3α.2.體外實(shí)驗(yàn)表明,放射誘導(dǎo)Egr-1啟動(dòng)子活性可增加該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的Lewis肺癌細(xì)胞MIP-3α的表達(dá),并可提高細(xì)胞培養(yǎng)液中分泌型MIP-3α蛋白水平.3.在C57BL/6J小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)中顯示,接受重組質(zhì)粒的靜脈高容量基因治療聯(lián)合放射治療的荷瘤小鼠,腫瘤組織內(nèi)MIP-3αmRNA表達(dá)顯著增高,DC和CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)最多,小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度減慢.以上結(jié)果說(shuō)明,Egr-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)MIP-3α表達(dá)增高對(duì)腫瘤局部的免