啟動自身免疫的多靶向抗腫瘤復合制劑研究.pdf

1、目的：
　　腫瘤疫苗開發(fā)成本高昂且腫瘤細胞有免疫逃逸等特性，本研究在抗原-抗體結合和受配體結合理論的基礎上，引入新的免疫原(DOX-BSA)刺激機體產生抗DOX抗體，并在小分子(FA-DOX)橋聯作用下靶向腫瘤細胞，以期得到一種可增強腫瘤細胞免疫原性的廉價復合物大分子達到清除腫瘤細胞并長期檢測的目的。免疫療法毒副作用小且效果持久溫和，但免疫治療周期較長，為防止腫瘤過度發(fā)展，因此在免疫治療前期介入Fu泡囊給藥系統(tǒng)抑制腫瘤的發(fā)展進程，

2、提高治療效果。
　　方法：
　　1）通過縮醛法合成制備泡囊所需高分子材料F127-Chol并對其進行純化和鑒別。
　　2）溶劑注入法制備Fu泡囊，分別采用超濾離心法和透析法測定包封率，以粒徑和包封率為評價指標，采用單因素考察法對泡囊的處方及其制備工藝進行優(yōu)化，對制備的泡囊的粒徑、電位、包封率進行測定，通過透射電鏡觀察制備的泡囊的形態(tài)，對泡囊在模擬正常體液和模擬癌細胞環(huán)境的釋放規(guī)律進行考察。
　　3）為考察泡囊在體

3、外的抗腫瘤活性，以鼠源性乳腺腫瘤細胞4T1為腫瘤模型細胞，通過細胞毒性試驗（MTT法）考察泡囊殺死腫瘤細胞的能力，并進一步通過流式細胞儀檢測與藥物共包載于泡囊內的熒光物質羅丹明G6的攝取量，考察泡囊進入腫瘤細胞的能力。
　　4）以4T1細胞、5-6周齡的雌性balb/c小鼠建立動物模型，以瘤體積增長倍數和抑瘤率為指標，考察泡囊實際的抗腫瘤效果。
　　5）為獲得所需免疫原，以戊二醛交聯法合成外源性半抗原DOX-BSA，以透析法

4、純化后，通過紫外-可見分光光度法和傅里葉轉換紅外分光光度法對其進行鑒別。
　　6）為評估所得免疫原的免疫原性，以5-6周齡的雌性balb/c小鼠為模型動物，制備多克隆抗體，并通過ELISA以游離DOX競爭抑制后測定，繪制相應抑制標準曲線。
　　7）合成分子橋FA-DOX，以不良溶劑沉淀純化后，通過液-質聯用和核磁共振法對其進行鑒定。
　　8）為證實免疫復合物大分子的存在及分子橋在免疫復合物形成過程中的作用，以4T1細胞

5、為模型細胞，含抗阿霉素抗體的小鼠抗血清為抗體，二抗-HRP為檢測信號標志物，測定其細胞酶聯免疫吸附分析法的吸光度值，考察腫瘤細胞FR~FA-DOX~抗血清~二抗-HRP免疫復合物的形成；為考察FA-DOX分子橋的主動靶向功能及化療效果，分別進行了流式細胞攝取試驗、熒光顯微鏡和細胞毒性試驗。
　　9）為考察免疫治療聯合化療的抗腫瘤效果，以4T1細胞、5-6周齡的雌性balb/c小鼠建立動物模型，以瘤體積增長倍數和抑瘤率為指標，考察該

6、復合療法實際的抗腫瘤效果；以組織切片圖譜為基礎，考察不同給藥組別對腫瘤細胞的殺傷情況以及其對其他器官的毒性。
　　結果：
　　1）制備的材料純化后，經傅里葉轉換紅外分光光度法和核磁共振氫譜結果均證明成功合成了高分子材料F127-Chol。
　　2）制得的泡囊為較規(guī)整球形，平均粒徑(240.410.07)nm，Zeta電位-68.37 mV，FALT為1.83 nm；包封率32.76％；體外釋放符合Weibull模型，在

7、模擬正常體液的環(huán)境中釋放藥物明顯減緩（t1/2為游離Fu的3.47倍）。
　　3）細胞毒性試驗（MTT法）結果顯示，泡囊對4T1的細胞毒性呈現時間及濃度依賴性，24 h時各組IC50(μg.ml-1)值分別為：泡囊38.02±1.93；以市售材料制備的對照泡囊71.78±2.17；空白泡囊+游離藥物193.57±2.29；游離藥物207.068±3.58；空白泡囊927.14±5.93。流式細胞攝取術結果顯示，細胞攝取：泡囊>空白

8、泡囊+藥≈游離藥物。
　　4）荷瘤鼠在給藥第23天時，泡囊組、對照泡囊組、Fu組和生理鹽水組的腫瘤體積增長倍數分別為64.44、81.16、105.87、150.28，算得各組抑瘤率依次為52.49%、33.90%和20.85%，泡囊組均明顯高于對照泡囊組及Fu組（p<0.05）。
　　5）制備的免疫原DOX-BSA純化后，經紫外-可見風光光度法和傅里葉轉換紅外分光光度法分析，均表明DOX-BSA合成成功。
　　6）E

9、LISA法證實，獲得的多克隆抗體能明顯被DOX競爭性抑制，且其IC50值為75.77±2.81 ng.ml-1，完全達到本研究所需靈敏度。
　　7）液相-質譜聯用檢測和核磁共振氫譜均證明分子橋FA-DOX合成成功。
　　8）細胞ELISA試驗中，FA-DOX+抗血清組>>FA-DOX+陰性血清組>FA+DOX+抗血清組>PBS組>FA-DOX+PBS組，分別為FA-DOX+陰性血清組的1.76、FA+DOX+抗血清組的2.1

10、3、PBS組的2.45和FA-DOX+PBS組的2.87倍；除FA-DOX+抗血清組外其余各組與PBS組比較均無顯著性差異（P均>0.05），證明了目標大分子免疫復合物的存在，且抗體和FA-DOX在該復合物中缺一不可。流式細胞攝取術結果顯示，給藥2 h時各組細胞攝取阿霉素含量的規(guī)律為：FA-DOX組>FA+FA-DOX組>DOX，且FA-DOX組為DOX組的1.45倍，為FA+FA-DOX的1.05倍，說明分子橋FA-DOX有明顯的靶向

11、功能，且游離葉酸的加入可限制分子橋的攝入。熒光顯微鏡檢測結果表明：各組細胞內熒光強度均隨時間延長而增強，表明隨著時間進展藥物的攝取量增加，其中，2 h時，各組攝取均較少，因此，組間差異并未明顯體現出來，與流式細胞攝取術結果吻合。4 h時，FA-DOX組的攝取量分別為DOX組的2.09倍和FA+FA-DOX組的1.71倍，顯著高于DOX組和FA+FA-DOX組；另外，FA+FA-DOX組僅為DOX組的1.22倍，說明FA-DOX進入細胞通

12、過FA介導的FA-FR途徑，且受游離FA的競爭性抑制。6 h的結果與4 h類似，其中，FA-DOX組的攝取量分別為DOX組的2.06倍和FA+FA-DOX組的1.76倍；FA+FA-DOX組為DOX組的1.19倍。在MTT試驗中FA-DOX各時間點的細胞IC50（μg.ml-1）分別為：24h：0.99±0.02；48h：0.28±0.07；72h：0.26±0.04。各組對4T1的細胞生長抑制率依次為：FA-DOX>>FA+FA-DO

13、X＞DOX。9）在荷瘤鼠體內抑瘤試驗中，當給藥第27天時，各組的腫瘤體積增長倍數分別為：生理鹽水為36.16、免疫+FA-DOX+泡囊為8.99、免疫+FA-DOX+對照泡囊為12.75、免疫+FA-DOX+Fu為15.08、免疫+FA-DOX+生理鹽水為18.98、免疫+FA+DOX+泡囊為17.68、免疫+FA+DOX+對照泡囊為22.40和FA-DOX+泡囊為13.04；以生理鹽水組為基準，算得以上其余各組的抑瘤率依次分別為75.

14、15%、64.73%、58.29%、47.48%、48.89%、38.06%和63.93%。H&E染色結果表明：與生理鹽水組對比，各給藥組腫瘤組織出現不同程度的細胞損傷及出血，其中損傷程度依次為免疫+FA-DOX+泡囊組>免疫+FA-DOX+Fu組>免疫+FA-DOX+生理鹽水組≈FA-DOX+泡囊組>免疫+FA+DOX+泡囊組>生理鹽水組。
　　結論：
　　制得的泡囊理化性能較好，有利于將藥物傳輸至癌組織釋放并發(fā)揮作用，細