腫瘤細胞來源的exosomes促進胃癌細胞增殖和誘導(dǎo)T細胞凋亡的機理研究.pdf

1、目的： 惡性腫瘤嚴重威脅著人類的健康，在各種疾病所致的死亡中，惡性腫瘤已成為主要病因，并有進一步增高的趨勢。目前傳統(tǒng)治療方法如手術(shù)、放療和化療雖有一定療效，但卻十分有限，常難以徹底消滅腫瘤細胞。而免疫治療特別是腫瘤疫苗的研究日益受到人們的重視，顯示出良好的應(yīng)用前景，為腫瘤治療帶來了新的希望，其中exosomes亞細胞疫苗的研制成為目前腫瘤治療研究的熱點之一。 Exosomes是由細胞分泌至胞外的膜性小囊泡，人們早于19

2、87年發(fā)現(xiàn)exosomes，但是直至最近幾年有關(guān)exosomes基礎(chǔ)與臨床的研究才得到更多的關(guān)注，這主要歸因于它的抗腫瘤作用的發(fā)現(xiàn)。目前，exosomes的研究進入了一個新的階段，對其功能有了更多的認識，發(fā)現(xiàn)其作用并不限于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答以及抗腫瘤作用，此外還能夠誘導(dǎo)免疫耐受。因此，研究腫瘤來源的exosomes對腫瘤細胞增殖的影響及其在免疫方面的作用機制可為腫瘤的免疫治療提供理論依據(jù)。 磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyli

3、nositol3—kinase，PI3K)/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細絲裂原活化蛋白激酶(mitogen—activated protein kinase，MAPK)/胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal—regulated protein kinase，ERK)在維持細胞生存和抑制細胞凋亡中起關(guān)鍵作用，近年來發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但PI3K/Akt和MAPK/ERK通路在exosomes促進腫瘤細胞增殖和

4、誘導(dǎo)T細胞凋亡中的作用目前尚未見報道。 Cbl家族蛋白(Cbl—b和c—Cbl)是一種高度保守的RING家族E3泛素連接酶，在維持T細胞穩(wěn)態(tài)和免疫耐受方面發(fā)揮著重要作用。研究表明它不僅能設(shè)定T細胞活化的閾值，而且能通過特異性地選擇底物蛋白啟動泛素化降解途徑而參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負向調(diào)控。目前越來越多的證據(jù)表明E3泛素連接酶Cbl—b(Casitas B lineage lymphoma—b)在T細胞CD3激活誘導(dǎo)的細胞死亡中起

5、重要作用，但關(guān)于Cbl蛋白在exosomes誘導(dǎo)的T細胞凋亡中的作用不清楚。 本課題以胃癌SGC7901細胞為模型，分離出腫瘤細胞來源的exosomes，初步觀察了其對腫瘤細胞增殖和T細胞凋亡的影響，并對PI3K/Akt、MAPK/ERK通路及其上游分子泛素連接酶Cbl家族蛋白在此過程中的調(diào)控機制進行了探討。 材料與方法： 1、采用離心超濾和蔗糖密度梯度離心的方法從胃癌SGC7901細胞的上清液中分離出腫瘤來源的

6、exosomes。 2、透射電子顯微鏡下觀察exosome形態(tài)。 3、采用MTT法和臺盼藍拒染法測定細胞活力，繪制增殖曲線。 4、采用流式細胞儀PI染色檢測細胞凋亡。 5、采用瑞氏—姬姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化。 6、采用Western blot檢測蛋白的表達。 7、統(tǒng)計學(xué)處理：每次實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。 實驗結(jié)果：

7、 1、采用離心超濾和蔗糖密度梯度離心的方法從胃癌SGC7901細胞的上清液中分離出腫瘤來源的exosomes。透射電子顯微鏡下觀察exosomes具有特征性的盤狀結(jié)構(gòu)，由雙層膜構(gòu)成，它們的直徑在30-100 nm之間。Western blot結(jié)果顯示和等量的SGC7901細胞裂解物相比，exosomes表面富含HLA—A、CD9和TSG101分子。 2、SGC7901細胞來源的exosomes以時間和劑量依賴性的方式促進SGC

8、7901細胞和BGC823細胞的增殖。200μg/ml和400μg/ml的exosomes處理SGC7901細胞72h，細胞的增殖比率分別是對照組的142％和145％；處理BGC823細胞72h，細胞的增殖比率分別是對照組的129％和138％。 3、Exosomes以時間和劑量依賴性的方式上調(diào)p—Akt和p—ERK1/2的表達，200μg/ml的exosomes作用于SGC7901細胞72h后，p—Akt和p—ERK1/2的表達

9、水平分別是對照組的3.52和3.16倍。10μM LY294002預(yù)處理SGC7901細胞1h阻斷PI3K/Akt信號通路的活性后，再加入200μg/ml的exosomes繼續(xù)作用72h，能使p—Akt的表達恢復(fù)至基線水平。同樣，10μM PD98059預(yù)處理SGC7901細胞1h阻斷MAPK/ERK的活性后，再加入200μg/ml的exosomes繼續(xù)作用72h，能逆轉(zhuǎn)exosomes誘導(dǎo)的ERK1/2的活化。相應(yīng)的MTT結(jié)果顯示LY

10、294002和PD98059能部分逆轉(zhuǎn)exosomes的促增殖作用。 4、200μg/ml的exosomes作用于SGC7901細胞24、48和72h，Western blot結(jié)果顯示，exosomes能下調(diào)Cbl—b和c—Cbl的表達，24h時兩者的表達水平輕度下調(diào)(分別是對照組的0.78和0.85倍)，72h時下調(diào)最明顯(分別是對照組的0.35和0.09倍)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)exosomes下調(diào)Cbl—b和c—Cbl的表達存

11、在劑量依賴性。 5、不同濃度的exosomes作用于Jurkat T細胞(3×105/ml)24、48和72h。臺盼藍拒染法顯示exosomes以時間和劑量依賴性的方式抑制Jurkat T細胞增殖。流式細胞儀分析顯示不同濃度的exosomes作用于Jurkat T細胞48h后，exosomes能誘導(dǎo)Jurkat T細胞凋亡。400μg/ml的exosomes作用于Jurkat T細胞48h后，有31.76％的細胞發(fā)生了凋亡，而對

12、照組僅有2.47％的細胞發(fā)生凋亡(p<0.01)。同時瑞氏—姬姆薩染色可見典型的凋亡形態(tài)改變，表現(xiàn)為細胞膜完整，細胞質(zhì)固縮，胞核固縮或碎裂，可見凋亡小體。400μg/ml的exosomes分別作用于Jurkat T細胞24和48h，Western blot結(jié)果顯示exosomes作用24h能檢測裂解的Caspase—3、Caspase—8和Caspase—9片段，48h時更明顯。 6、400μg/ml的exosomes分別作用于

13、Jurkat T細胞24和48h，Western blot結(jié)果顯示，exosomes能上調(diào)Cbl—b和c—Cbl的表達，24h時兩者的表達水平輕度上調(diào)(分別是對照組的1.10和1.23倍)，48 h時明顯上調(diào)(分別是對照組的2.04和1.86倍)。進一步檢測Cbl蛋白的下游分子Akt，發(fā)現(xiàn)exosomes以時間依賴性的方式下調(diào)p—Akt的表達，且p—Akt表達的下調(diào)與Cbl蛋白表達的上調(diào)同時發(fā)生。用蛋白酶體和Cbl蛋白的功能性抑制劑PS

14、—341抑制Cbl泛素連接酶的功能。結(jié)果顯示，10 nM PS—341預(yù)處理Jurkat T細胞4h，然后加入終濃度為400μg/ml的exosomes，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后細胞凋亡較單純exosomes組明顯減少，同時Western blot結(jié)果顯示PS—341部分逆轉(zhuǎn)了exosomes下調(diào)p—Akt表達的作用。 結(jié)論： 1、離心超濾和蔗糖密度梯度離心純化exosomes方法可行。胃癌SGC7901細胞來源的exosom

15、es為直徑在30-100 nm之間的囊性小泡，表達HLA—A、CD9和TSG101分子。 2、胃癌SGC7901細胞分泌的exosomes能以時間和劑量依賴性的方式促進SGC7901和BGC823細胞增殖 3、Exosomes在促進胃癌SGC7901細胞增殖過程中上調(diào)了p—Akt和p—ERK的表達。抑制PI3K/Akt和MAPK/ERK通路的活性可部分逆轉(zhuǎn)exosomes促進SGC7901細胞增殖的作用。提示激活PI3K

16、/Akt和MAPK/ERK通路是exosomes促進腫瘤細胞增殖的機制之一。 4、Exosomes在促進胃癌SGC7901細胞增殖過程中下調(diào)了Cbl—b和c—Cbl的表達。 5、胃癌SGC7901細胞來源的exosomes能抑制Jurkat T細胞的增殖，并誘導(dǎo)Jurkat T細胞凋亡，在凋亡過程中伴有Caspase—3、Caspase—8和Caspase—9的活化。 6、胃癌SGC7901細胞來源的exosom