β-防御素2與克羅恩病的相關(guān)性研究.pdf

1、背景和目的： 克羅恩病(Crohn's disease，CD)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的一個(gè)主要類型，是一種腸道慢性透壁性炎癥性疾病(transmuralinflammation)。CD在西方國(guó)家常見，發(fā)病率約為10/萬(wàn)～100/萬(wàn)左右。近20年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)臨床醫(yī)生對(duì)CD的認(rèn)識(shí)加深，以及雙氣囊小腸鏡的應(yīng)用，CD發(fā)病率在我國(guó)有逐年上升趨勢(shì)。該病病因及發(fā)病機(jī)制至今不明，臨床表現(xiàn)復(fù)雜

2、多樣，易誤診，目前尚無(wú)徹底治愈方法，常用藥物治療效果欠佳，罹患者即在手術(shù)切除病變腸段后，也可能會(huì)復(fù)發(fā)而成為終身致殘性疾病，嚴(yán)重危害人類健康。 既往對(duì)CD的研究多集中于潛在的特異性黏膜免疫功能失調(diào)，以及相關(guān)的黏膜細(xì)胞群和細(xì)胞因子在黏膜損害的病理方面，有關(guān)腸黏膜屏障保護(hù)作用在炎癥性腸病上的研究甚少。近年來(lái)，研究人員認(rèn)為腸道黏膜防御素在維持黏膜平衡中發(fā)揮重要作用，防御素缺乏或誘導(dǎo)缺陷可以導(dǎo)致細(xì)菌逐漸入侵，啟動(dòng)炎癥過(guò)程，降低黏膜耐受能力

3、，導(dǎo)致疾病發(fā)生，且越來(lái)越多的證據(jù)表明在黏膜屏障防御功能上CD和UC可能存在著不同。 研究表明：哺乳動(dòng)物(包括人)防御素是一類陽(yáng)離子多肽，包括α-防御素(HNP1-4和HD5-6)和β-防御素(HBD-1、HBD-2、HBD-3)兩個(gè)家族，基因均定位于8號(hào)染色體上，分子量為3～5kD，相距不超過(guò)100～150kb，它們享有共同的起源。其中α-防御素中HNP1-4主要分布在中性粒細(xì)胞中，稱為髓源性防御素；HD5-6主要由腸道內(nèi)潘氏細(xì)

4、胞所合成分泌，稱為腸源性防御素。β-防御素則廣泛存在于皮膚、腸道及肺臟的上皮細(xì)胞內(nèi)，是機(jī)體重要的內(nèi)源性生物防御屏障，由36～42個(gè)氨基酸殘基組成，分子內(nèi)3個(gè)二硫鍵組成特征性的β片層結(jié)構(gòu)。其表達(dá)分為結(jié)構(gòu)型和誘導(dǎo)型，HBD-1在組織中表達(dá)呈結(jié)構(gòu)型，可持續(xù)型表達(dá)，HBD-2和HBD-3主要出現(xiàn)在病灶區(qū)域，在皮膚、腸道及肺等上皮組織受到TNF-α，LI-1β刺激或直接與細(xì)菌莢膜等接觸時(shí)，成誘導(dǎo)型表達(dá)。其中，β-防御素-2(HBD-2)不但參于機(jī)

5、體的先天性免疫，而且還可刺激未成熟的樹突狀細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞參于獲得性免疫反應(yīng)。因此，機(jī)體防御素水平將影響機(jī)體抵抗微生物入侵的能力與感染者的預(yù)后。同時(shí)，先天性免疫功能下降，導(dǎo)致機(jī)體觸發(fā)對(duì)正常腸黏膜上皮的一種異常炎癥反應(yīng)，可能會(huì)引起CD發(fā)病。近年來(lái)，研究人員認(rèn)為腸道黏膜防御素在維持黏膜平衡中發(fā)揮重要作用，防御素缺乏或誘導(dǎo)缺陷可以導(dǎo)致細(xì)菌逐漸入侵，啟動(dòng)炎癥過(guò)程，降低黏膜耐受能力，同時(shí)，腸道正常菌群也可能因先天性宿主防御功能的損害而參與慢性炎

6、癥過(guò)程，導(dǎo)致了CD的發(fā)病，且越來(lái)越多的證據(jù)認(rèn)為黏膜防御功能的改變同CD發(fā)病相關(guān)。本研究以正常大腸黏膜組織、CD患者腸黏膜組織及UC患者腸黏膜組織為研究對(duì)象，采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)及原位雜交(in situhybridization，ISH)方法，從蛋白和mRNA水平對(duì)HBD-2進(jìn)行檢測(cè)，探討HBD-2在CD發(fā)病機(jī)制中的作用及其意義；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了TNF-α及IL-1β在正常大腸黏

7、膜、CD和UC病變黏膜的蛋白表達(dá)，以評(píng)估TNF-α及IL-1β與IBD疾病程度的相關(guān)性。 目前，國(guó)外多項(xiàng)研究證明CD是一種復(fù)雜的多基因疾病，遺傳因素與環(huán)境因素相互作用導(dǎo)致CD的發(fā)病已逐漸被認(rèn)可，因此，從基因水平上研究CD的發(fā)生發(fā)展及臨床特征，是目前研究的主流，其主要任務(wù)是闡明其發(fā)病的病因及發(fā)病機(jī)制，尋找其相關(guān)的易感基因，對(duì)這一研究的突破不僅能使我們更好地理解CD發(fā)生的病理生理機(jī)制，而且還將能指導(dǎo)我們對(duì)CD進(jìn)行早期診斷、預(yù)防和治療

8、。因此，為探討HBD-2基因是否為CD發(fā)病的易感基因，用PCR-直接測(cè)序法，以廣東地區(qū)漢族人群為研究對(duì)象，采用病例對(duì)照研究的方式，對(duì)HBD-2基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行基因多態(tài)性的初步分析，以進(jìn)一步探討HBD-2是否與CD的發(fā)病存在著相關(guān)性。 材料和方法： 1、收集南方醫(yī)院消化科及普外科確診的CD患者45例，門診健康體檢50例，空腹抽靜脈血5ml；收集其中32名CD患者腸黏膜，同時(shí)收集確診的UC患者腸黏膜35例，正常腸黏膜30例。

9、 2、將收集到的腸黏膜標(biāo)本做石蠟包埋后行連續(xù)4mm切片，利用IHC和ISH方法檢測(cè)HBD-2在mRNA與蛋白水平上的表達(dá)；利用IHC方法檢測(cè)TNF-α和IL-1β在三者腸黏膜上的蛋白表達(dá)。 3、將收集的靜脈血分別提取基因組DNA后，根據(jù)所需啟動(dòng)子區(qū)片段的大小設(shè)計(jì)引物，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段。將PCR產(chǎn)物純化后采用直接測(cè)序法測(cè)定全序列，并與基因庫(kù)數(shù)據(jù)對(duì)照，以發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)。 結(jié)果： 1、免疫組化及

10、原位雜交染色結(jié)果分析： 免疫組化結(jié)果顯示HBD-2蛋白水平在CD、UC和正常對(duì)照三者的腸黏膜上表達(dá)差異具有顯著性意義(P=0.000)，HBD-2在CD患者腸黏膜上的陽(yáng)性表達(dá)率為43.8％，在UC患者腸黏膜上的表達(dá)率為77.1％，二者比較差異具有顯著性意義(P=0.018)。原位雜交結(jié)果同免疫組化結(jié)果一致，HBD-2在CD、UC和正常對(duì)照三者的腸黏膜mRNA水平上的表達(dá)差異有顯著性意義(P=0.000)。HBD-2在UC患者腸黏

11、膜上表達(dá)較高，表達(dá)陽(yáng)性率為62.9％，CD患者腸黏膜上HBD-2的陽(yáng)性表達(dá)率是34.4％，二者比較差異有顯著性意義(P=0.028)。TNFα及IL-1β在CD及UC中均為陽(yáng)性表達(dá)，二者比較差異無(wú)顯著性意義(P=0.675和P=0.464)，且隨著CD和UC的病情加重表達(dá)程度也明顯增加，正常組織這兩者無(wú)或僅有弱陽(yáng)性表達(dá)。 2、HBD-2啟動(dòng)子區(qū)基因測(cè)序結(jié)果分析： 通過(guò)PCR-直接測(cè)序法檢測(cè)病例組及對(duì)照組進(jìn)行分析比對(duì)后發(fā)現(xiàn)

12、有4例患者存在著HBD-2上游啟動(dòng)子區(qū)-233(C→G)位點(diǎn)存在著基因多態(tài)現(xiàn)象，而50名正常對(duì)照并未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。二者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)。 結(jié)論： 1、HBD-2在CD和UC患者腸黏膜上存在的表達(dá)差異，CD患者可能存在HBD表達(dá)的缺陷，HBD-2可能在CD發(fā)病機(jī)制上起了重要的作用。 2、TNF-α與IL-1β同IBD疾病的病情程度相關(guān)，將來(lái)作為病情嚴(yán)重程度評(píng)定的指標(biāo)及藥物治療的依據(jù)。 3、