脂肪基質(zhì)細(xì)胞多向分化能力及其在組織工程中應(yīng)用的研究.pdf

1、在臨床醫(yī)學(xué)中，因創(chuàng)傷、感染、腫瘤術(shù)后及先天缺陷導(dǎo)致組織缺損的修復(fù)重建，一直是困擾各專業(yè)醫(yī)生的棘手難題。當(dāng)前臨床上使用的各種組織修復(fù)與重建方法雖然各有優(yōu)缺點(diǎn)，但總體來(lái)說(shuō)不盡人意。組織工程是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理，對(duì)病損組織結(jié)構(gòu)、功能的修復(fù)與重建進(jìn)行研究開發(fā)的一門新興科學(xué)。種子細(xì)胞是組織工程的首要因素，脂肪基質(zhì)細(xì)胞(Adipose tissue-derivedstromal cells，ASCs)是近年來(lái)研究最熱門的種子細(xì)胞，被認(rèn)為是

2、最有可能用于臨床的種子細(xì)胞之一。ASCs具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞等多向分化的能力，加之脂肪貯備量大、取材方便的優(yōu)勢(shì)，使其更具實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。 本課題采用酶消化法獲取綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞，通過體外多向誘導(dǎo)的培養(yǎng)方法，研究?jī)?nèi)源性GFP對(duì)ASCs分化能力的影響；然后以腺病毒(Adenoviral vectors，Ad)為載體，轉(zhuǎn)染外源性G

3、FP基因到Balb／c小鼠ASCs中，比較內(nèi)、外源性GFP對(duì)小鼠ASCs分化能力的影響；進(jìn)而研究外源性GFP對(duì)人脂肪基質(zhì)細(xì)胞分化能力的影響。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合組織工程的方法，研究ASCs體外成軟骨分化能力，并使用經(jīng)過成軟骨誘導(dǎo)的ASCs復(fù)合藻酸鹽支架材料，種植于裸鼠皮下，研究ASCs形成異位軟骨組織的能力；再使用經(jīng)過成骨誘導(dǎo)的ASCs復(fù)合納米雙相磷酸鈣陶瓷支架材料，研究ASCs異位及原位成骨能力。 研究結(jié)果顯示： 1．GF

4、P轉(zhuǎn)基因小鼠的脂肪基質(zhì)細(xì)胞在表達(dá)內(nèi)源性GFP的同時(shí)，仍保持了向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞、成肌細(xì)胞等方向的分化能力，二者沒有明顯的相互影響，提示GFP轉(zhuǎn)基因小鼠ASCs是一種理想的細(xì)胞模型； 2．Ad-GFP轉(zhuǎn)染的Balb／c小鼠ASCs與GFP轉(zhuǎn)基因小鼠ASCs具有相似的生長(zhǎng)、增殖特性；二者在成軟骨分化過程中，SOX9、Aggrecan、Col-I、Col-II、C0l-X基因以及C0l-I、C0l-II蛋白的表達(dá)時(shí)間和強(qiáng)

5、度基本相同，說(shuō)明可以用Ad-GFP轉(zhuǎn)染Balb／c小鼠ASCs來(lái)替代GFP轉(zhuǎn)基因小鼠ASCs進(jìn)行脂肪基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記、追蹤；Ad-GFP轉(zhuǎn)染為ASCs的研究提供了高效、低毒、廉價(jià)的標(biāo)記方法； 3．Ad-GFP轉(zhuǎn)染人脂肪基質(zhì)細(xì)胞，可以獲得80％以上的轉(zhuǎn)染效率，而人脂肪基質(zhì)細(xì)胞在表達(dá)外源性GFP的同時(shí)仍可以分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，這將為人脂肪細(xì)胞移植提供良好的細(xì)胞標(biāo)記； 4．人脂肪基質(zhì)細(xì)胞體外單層培養(yǎng)時(shí)，

6、經(jīng)過成軟骨誘導(dǎo)后，可以分化為成軟骨細(xì)胞；在此基礎(chǔ)上，使用經(jīng)過成軟骨誘導(dǎo)的人脂肪基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合可注射式藻酸鈉支架，種植于裸鼠皮下，檢測(cè)到軟骨特異性基因SOX9、Aggrecan、Link Protein、COMP、C01-I、C01-II、C01-X以及特異性蛋白Col-I、Col-II、C0l-X、GAG的表達(dá)，說(shuō)明人脂肪基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后可用作種子細(xì)胞形成異位軟骨組織，為軟骨組織工程研究提供了新的種子細(xì)胞； 5．ASCs復(fù)合

7、納米雙相磷酸鈣陶瓷(NanoBCP)異位及原位成骨能力研究中，通過大體觀察、X射線檢查、HE染色、三色染色、免疫組化染色、RT-PCR等方法從組織學(xué)、基因和蛋白水平證實(shí)經(jīng)過成骨誘導(dǎo)的ASCs復(fù)合NanoBCP有顯著的異位成骨能力，并可以修復(fù)大鼠自體顱骨極量缺損，ASCs將為骨組織工程的研究開辟新的途徑； 6．第一鰓弓外胚間充質(zhì)細(xì)胞可以定向分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成肌細(xì)胞和成牙本質(zhì)樣細(xì)胞，具有多

8、向分化潛能，顯示了良好的可塑性，可用作牙頜面組織工程學(xué)的種子細(xì)胞來(lái)源。 綜上所述，本研究在國(guó)內(nèi)首次對(duì)人／動(dòng)物的脂肪基質(zhì)細(xì)胞多向分化潛能進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，深入探討了ASCs定向分化的關(guān)鍵基因和信號(hào)分子，闡述了脂肪基質(zhì)細(xì)胞的分化機(jī)制；在國(guó)內(nèi)外首次證實(shí)了腺病毒載體轉(zhuǎn)染外源性GFP對(duì)ASCs分化沒有明顯的影響，可以采用Ad-GFP轉(zhuǎn)染的方法標(biāo)記人／動(dòng)物脂肪基質(zhì)細(xì)胞，為ASCs的體內(nèi)追蹤和研究找到了一種成本低廉、操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)