重癥急性胰腺炎肝損傷機(jī)制及褪黑素保護(hù).pdf

1、目的： 觀察重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)大鼠肝組織核因子кB(NF-кB)表達(dá)活性與肝臟損傷的關(guān)系，探討褪黑素(melatonin，Mel)在大鼠急性胰腺炎肝臟損傷中的保護(hù)作用。 方法： 1.健康雄性SD大鼠96只，隨機(jī)分成重癥急性胰腺炎(SAP)組、褪黑素干預(yù)(Mel)組及假手術(shù)(Sham)組，每組各32只。采用胰膽管末端穿刺逆行注入3.5％?；悄懰徕c(0.1ml

2、/100g體重)制備SAP模型。Sham組模擬造模手術(shù)情況，輕柔胰腺及十二指腸數(shù)次，關(guān)腹。Mel組在建立SAP模型前30min腹腔注射褪黑素50mg/kg體重。SAP組和Sham組則予以生理鹽水，劑量及方法同Mel組。 2.造模成功后4、12、24、48h4個(gè)時(shí)點(diǎn)處死大鼠，各個(gè)時(shí)點(diǎn)各組8只。各時(shí)點(diǎn)由下腔靜脈抽血8～10ml，離心后留上層血清，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。取部分胰腺組織和新鮮肝臟肝中葉組織固定于4％甲醛液，待行光鏡、免

3、疫組織化學(xué)、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢查。 3.人工碘比色法檢測(cè)血清淀粉酶(AMY)及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)含量，酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。 4.胰腺和肝臟組織行常規(guī)病理學(xué)檢查，免疫組化evision二步法檢測(cè)肝臟組織NF-кB的表達(dá)，缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TU

4、NEL)法檢測(cè)肝臟細(xì)胞凋亡情況。 5.計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析、SNKq檢驗(yàn)和Kruskal Wallis H檢驗(yàn)，結(jié)果以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.血清淀粉酶及ALT的檢測(cè)結(jié)果：SAP組和Mel組各時(shí)點(diǎn)淀粉酶和ALT水平均較Sham組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SAP組4、12、24h和48hAMY和ALT水

5、平逐步上升，以48h為著。Mel組AMY和ALT水平較同時(shí)間點(diǎn)SAP組均顯著降低(P<0.05)。 2.血清TNF-α的檢測(cè)結(jié)果：TNF-α4h各組間無明顯差異，SAP組于12時(shí)TNF-α開始明顯升高，且隨時(shí)間推移逐漸升高，與Sham組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Mel組12、24、48各時(shí)間點(diǎn)TNF-α的含量均低于SAP組(P<0.05)。 3.肝組織NF-кB表達(dá)活性：NF-кB免疫組化染色結(jié)果顯示在Sh

6、am組肝組織中存在散在的陽性染色細(xì)胞，且陽性染色主要位于胞漿，細(xì)胞核基本不著色；Mel組肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和肝枯否細(xì)胞胞核及胞漿染色程度均較SAP組輕，陽性細(xì)胞數(shù)減少；SAP組肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和肝枯否細(xì)胞有深染的NF-кB陽性細(xì)胞，其染色以細(xì)胞核為主，染色重，胞核輪廓清晰，胞漿也可見陽性染色，但程度較胞核淡。 4.肝細(xì)胞凋亡情況：Sham組偶見凋亡細(xì)胞，Mel組凋亡指數(shù)各時(shí)點(diǎn)較SAP組低。SAP組4h凋亡細(xì)胞較Sham組明顯增多，且隨著時(shí)間推

7、移，凋亡指數(shù)升高，24小時(shí)達(dá)高峰，此時(shí)可見不同時(shí)期的凋亡細(xì)胞。 5.肝臟組織形態(tài)學(xué)改變：光鏡下，Sham組肝組織肝索排列正常，肝細(xì)胞無變性，萎縮、壞死、炎細(xì)胞浸潤。Mel組48h可見局部出現(xiàn)凝固性壞死，對(duì)應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)損傷相應(yīng)較SAP組減輕。SAP組12h后出現(xiàn)肝細(xì)胞輕度水腫，氣球樣變，至24h可見肝細(xì)胞核固縮，核碎裂，肝竇擴(kuò)張充血，內(nèi)有少量炎細(xì)胞浸潤，隨著時(shí)間延長，損害進(jìn)一步加重，48 h可見肝細(xì)胞索排列紊亂，局部區(qū)域肝組織大片的

8、出血壞死，肝竇及匯管區(qū)周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤。 結(jié)論： 1.重癥急性胰腺炎激活了具有轉(zhuǎn)錄活性的核因子кB，肝組織核因子кB的活化介導(dǎo)了重癥急性胰腺炎的肝臟損傷。 2.在急性胰腺炎中，活化的核因子кB誘導(dǎo)了肝細(xì)胞的凋亡，隨著NF-кB的持續(xù)激活，其調(diào)控的TNF-α等炎癥介質(zhì)大量表達(dá)，從而引起肝細(xì)胞的壞死損傷。 3.Mel抑制了NF-кB的活性和TNF-α表達(dá)，減輕了肝臟細(xì)胞的凋亡和壞死從而減輕了肝臟的病理損傷