散結(jié)消癭方及溫腎健脾方對(duì)自身免疫性甲狀腺炎大鼠免疫學(xué)機(jī)制的研究.pdf

1、目的: 本課題通過(guò)觀察散結(jié)消癭方及溫腎健脾方對(duì)自身免疫性甲狀腺炎大鼠模型進(jìn)行干預(yù)、治療，深入探討散結(jié)消癭方及溫腎健脾方對(duì)自身免疫性甲狀腺炎的治療作用，從細(xì)胞凋亡及免疫應(yīng)答、細(xì)胞炎性因子方面進(jìn)一步明確其發(fā)病機(jī)制，并從中醫(yī)“痰瘀”及“脾腎虧虛”的角度來(lái)探討自身免疫性甲狀腺炎的中醫(yī)病機(jī)，進(jìn)一步加深對(duì)自身免疫性甲狀腺炎免疫學(xué)發(fā)病機(jī)理及中醫(yī)病機(jī)的認(rèn)識(shí)，為其治療提供新的思路。 方法: 將健康的雌性Wistar大鼠90只，體重

2、約120±20g，購(gòu)回后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為6組：正常組(G1)：15只；模型組(G2)：15只；雷公藤組(G3)：15只；散結(jié)消癭方組(G4)：15只；溫腎健脾方組(G5)：15只；散結(jié)消癭方及溫腎健脾方聯(lián)合治療組(G6)：15只。G1組給予普通飼料飼養(yǎng)；G2-G6組造模：將甲狀腺球蛋白100mg完全溶解于雙蒸水50ml中，取10ml與等體積完全弗化劑充分混合成油包水狀，取0.5ml在背、腹腔、腿、頸全身等多點(diǎn)皮下注射作為初次免疫

3、，第2周取甲狀腺球蛋白10ml與不完全弗化劑10ml充分混合后作為加強(qiáng)免疫，以后每周一次，至第5周，期間配合高碘水(1L水中加入0.64g碘化鈉配制)飲水喂養(yǎng)；第6周開(kāi)始，G2組給予普通飼料及飲水飼養(yǎng)至9周；G3組給予雷公藤片1.08mg/kg.d灌胃至10周；G4組給予散結(jié)消癭湯20g/kg.d灌胃至10周；G5組給予溫腎健脾方組20g/kg.d灌胃至10周；G6組給予散結(jié)消癭湯及溫腎健脾聯(lián)合方20g/kg.d灌胃至10周。

4、第11周將大鼠處死，取血并取出甲狀腺組織，做HE染色光鏡下觀察；TGAb、TpoAb、FT3、FT4、TSH按照試劑盒要求檢測(cè)；肝功能、腎功能、血液分析做生化及計(jì)數(shù)分析；TNF—α、IL-6用ELISA法檢測(cè)；甲狀腺上皮細(xì)胞CD40、Fas、FasL表達(dá)用免疫組化法檢測(cè)； 結(jié)果: 1．模型組血清TGAb和TPOAb較正常組升高，具有顯著性差異(P＜0.01)。雷公藤治療組TGAb和TPOAb較模型組降低，有顯著性差異(P

5、＜0.05)；散結(jié)消癭方組及聯(lián)合方治療組TGAb和TPOAb較模型組降低，有顯著性差異(P＜0.01)；散結(jié)消癭方組及聯(lián)合方治療組TGAb和TPOAb較雷公藤治療組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；溫腎健脾方組TGAb和TPOAb較模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；散結(jié)消癭方及聯(lián)合方治療組組間TGAb和TPOAb比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 光鏡結(jié)構(gòu)：正常組見(jiàn)完整濾泡上皮細(xì)胞，背景膠質(zhì)豐富，呈濃稠片7狀分布，濾泡間血

6、管豐富，未見(jiàn)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，上皮細(xì)胞未見(jiàn)嗜酸性變。模型組甲狀腺組織間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)廣泛的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，甲狀腺上皮細(xì)胞呈明顯的嗜酸性改變，并見(jiàn)淋巴組織分布于小葉內(nèi)及小葉周邊，形成具有生發(fā)中心的淋巴濾泡。雷公藤組、散結(jié)消癭方組、溫腎健脾方組及聯(lián)合方治療組甲狀腺組織間質(zhì)內(nèi)淋巴浸潤(rùn)較模型組明顯減少，小葉內(nèi)及小葉周邊形成具有生發(fā)中心的淋巴濾泡較模型組也明顯減少。淋巴細(xì)胞主要浸潤(rùn)范圍及程度較模型組也有所減少，散結(jié)消癭方組及聯(lián)合方治療組淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度

7、較雷公藤組及溫腎健脾方組明顯減少，范圍也明顯變小，濾泡上皮細(xì)胞嗜酸性變較雷公藤組及溫腎健脾方組變淺，未見(jiàn)明顯淋巴細(xì)胞形成的生發(fā)中心。 2．模型組淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度較正常組明顯增多，具有顯著性差異(P＜0.05)。雷公藤治療組、溫腎健脾方組淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度較模型組顯著降低，范圍明顯縮小，有顯著性差異(P＜0.05)；散結(jié)消癭方組及聯(lián)合方治療組淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度較模型組顯著降低，范圍明顯縮小，有顯著性差異(P＜0.01)；散結(jié)消癭方組、

8、聯(lián)合方治療組較雷公藤治療組淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度有所減少，有顯著性差異(P＜0.05)。溫腎健脾方組治療組淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度較雷公藤治療組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 3．甲狀腺功能：TSH含量正常組、模型組、雷公藤治療組、散結(jié)消癭方組、溫腎健脾方組及聯(lián)合方治療組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；FT3、FT4含量正常組、模型組、雷公藤治療組、散結(jié)消癭方組間無(wú)差異(P＞0.05)；溫腎健脾方組及聯(lián)合方治療組FT3、FT4較模型組有顯

9、著性差異(P＜0.05)。 4．造模前兩周模型組與正常組體重、進(jìn)食量及排泄量無(wú)明顯差異，從第三周起，模型組大鼠體重增加較正常組明顯減緩，進(jìn)食量相對(duì)減少，活動(dòng)減少，精神欠佳，大便干結(jié)，體重、進(jìn)食量及排泄量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 用藥干預(yù)后可見(jiàn)溫腎健脾方組較模型組、雷公藤治療組、散結(jié)消癭方組及聯(lián)合方治療組大鼠體重增幅明顯增大，飲食量、大便量明顯增多，活動(dòng)較其他組頻繁?？梢钥吹嚼坠僦委熃M大鼠食欲減退、活

10、動(dòng)量少考慮與其胃腸系統(tǒng)副作用有關(guān)。 模型組體溫較正常組明顯降低，具有顯著性差異(P＜0.01)。雷公藤治療組、散結(jié)消癭方組體溫較模型組明無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；溫腎健脾方組、聯(lián)合方治療組較其他組體溫有所上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)我們可以明顯觀察到溫腎健脾方組、散結(jié)消癭方組及聯(lián)合方治療組大鼠活動(dòng)及精神狀態(tài)明顯好于模型組。 5．模型組與正常組肝功能、血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白及血小板、肌酐、尿素氮無(wú)統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；雷公藤治療組AST、腎功能、血自細(xì)胞、紅細(xì)胞較正常組有顯著性差異(P＜0.05)；散結(jié)消癭方組、溫腎健脾方組及聯(lián)合方治療組AST、腎功能、血白細(xì)胞、紅細(xì)胞較雷公藤治療組有顯著性差異(P＜0.05)；散結(jié)消癭方組、溫腎健脾方組及聯(lián)合方治療組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 6．正常組甲狀腺組織Fas和FasL免疫陽(yáng)性物呈淺棕色，在甲狀腺上皮細(xì)胞表達(dá)很少，范圍很小，顏色較淺；模型組甲狀腺上皮細(xì)胞表達(dá)Fas和

12、FasL免疫陽(yáng)性物呈深棕色，表達(dá)范圍廣，顏色深，其OD值與正常組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。散節(jié)消癭方組、聯(lián)合方治療組較雷公藤治療組甲狀腺上皮細(xì)胞表達(dá)Fas和FasL顏色顯著變淺，OD值有顯著性差異(P＜0.05)。溫腎健脾方組較雷公藤治療組OD值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；散結(jié)消癭方組、聯(lián)合方治療組間甲狀腺上皮細(xì)胞表達(dá)Fas和FasL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 7．正常組甲狀腺上皮細(xì)胞表達(dá)CD40免疫陽(yáng)性物呈淺

13、棕紅色，表達(dá)范圍很?。荒Ｐ徒M甲狀腺上皮細(xì)胞表達(dá)CD40免疫陽(yáng)性物呈棕紅色，表達(dá)范圍廣，顏色深，其OD值與正常組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)；散節(jié)消癭方組、聯(lián)合方治療組甲狀腺上皮細(xì)胞表達(dá)CD40較雷公藤治療組顏色明顯變淺，OD值有顯著性差異(P＜0.05)。溫腎健脾方組較雷公藤治療組甲狀腺上皮細(xì)胞表達(dá)CD40無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。散結(jié)消癭方組、聯(lián)合方治療組間甲狀腺上皮細(xì)胞表達(dá)CD40差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

14、8．模型組血清TNF—α含量較正常組升高，具有顯著性差異(P＜0.01)。雷公藤治療組、散結(jié)消癭方組、聯(lián)合方治療組及溫腎健脾方組血清TNF—α較模型組降低，有顯著性差異(P＜0.01)；散結(jié)消癭方組及聯(lián)合方治療組血清TNF—α含量較雷公藤治療組及溫腎健脾方組降低，具有顯著性差異(P＜0.01)；散結(jié)消癭方組、聯(lián)合方治療組間血清TNF—α，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 9．模型組血清IL-6含量較正常組升高，具有顯著性差異(

15、P＜0.01)。雷公藤治療組、散結(jié)消癭方組、聯(lián)合方治療組及溫腎健脾方組血清IL-6較模型組降低，有顯著性差異(P＜0.01)；散結(jié)消癭方組及聯(lián)合方治療組血清IL-6含量較雷公藤治療組及溫腎健脾方組降低，具有顯著性差異(P＜0.01)；散結(jié)消癭方組、聯(lián)合方治療組間血清IL-6，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 結(jié)論: 1．散結(jié)消癭方可以減少自身免疫性甲狀腺炎自身抗體TGAb和TPOAb的形成，減少自身抗體對(duì)甲狀腺組織的損

16、傷。 2．散結(jié)消癭方及溫腎健脾方都能減少自身免疫性甲狀腺炎淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，減輕其炎性反應(yīng)，可以縮小腫大的甲狀腺，但散結(jié)消癭方療效尤其顯著，優(yōu)于雷公藤及溫腎健脾方。 3．溫腎健脾方可以增加大鼠食欲，進(jìn)食量及排泄量增大，升高大鼠基礎(chǔ)體溫，增強(qiáng)甲狀腺功能，并使自身免疫性甲狀腺炎大鼠基礎(chǔ)代謝增加，溫腎健脾方與雷公藤相比較，可避免其胃腸反應(yīng)，有效改善橋本氏甲狀腺炎的臨床癥狀。對(duì)改善自身免疫性甲狀腺炎表現(xiàn)出的甲狀腺功能減退癥狀及調(diào)節(jié)

17、甲狀腺功能效果明顯。治療效果優(yōu)于雷公藤片及散結(jié)消癭方。 4．散結(jié)消癭方、溫腎健脾方對(duì)大鼠肝、腎功能及血液系統(tǒng)有保護(hù)作用，優(yōu)于雷公藤。 5．散結(jié)消癭方、溫腎健脾方都能抑制TNF—α、IL-6過(guò)度分泌，減輕炎性因子對(duì)甲狀腺的損傷，但散結(jié)消癭方效果更為明顯，優(yōu)于雷公藤片及溫腎健脾方。 6．作為第二活化信號(hào)的共刺激分子CD40在自身免疫性甲狀腺炎中有異常表達(dá)，說(shuō)明CD40與自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)病有關(guān)，可以通過(guò)Th2途徑