hTERT RNAi和外源性PUMA基因聯(lián)合作用促M(fèi)CF-7細(xì)胞凋亡機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:構(gòu)建靶向人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因的RNA干擾(RNAi)真核表達(dá)載體和PUMA基因的真核表達(dá)載體,探討hTERT蛋白和PUMA蛋白在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)的相關(guān)性及hTERT基因干擾和外源性PUMA基因聯(lián)合作用促M(fèi)CF-7細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制,為hTERT基因干擾和外源性PUMA基因聯(lián)合作用作為腫瘤基因治療策略的應(yīng)用提供依據(jù)。
　　 方法:根據(jù)hTERT基因的RNA干擾靶序列GGAACACCAAGAAGTTCATCT

2、,設(shè)計(jì)合成具有該靶序列短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸,退火形成雙鏈:DNA,并定向克隆到真核表達(dá)載體pYr-2.1-hU6形成重組質(zhì)粒pYr-2.1-hTERT-shRNA。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,經(jīng)Kanar抗性篩選和CCDB致死基因篩選,挑選陽性克隆菌落進(jìn)行搖菌擴(kuò)增,并抽提純化質(zhì)粒,然后將抽提的重組質(zhì)粒進(jìn)行SacI酶切和瓊脂糖電泳分析,同時(shí)做測(cè)序鑒定以確定插入的干擾片段準(zhǔn)確無誤。同法構(gòu)建不針對(duì)任何基因的shRNA陰性對(duì)照質(zhì)粒pYr-

3、2.1-HK。將PUMA基因序列(gene bank NM_014417)克隆入質(zhì)粒pYr-ads-1,構(gòu)建PUMA真核表達(dá)質(zhì)粒pYr-ads-1-PUMA,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,經(jīng)Kanar抗性篩選,挑選陽性克隆菌落進(jìn)行搖菌擴(kuò)增,并抽提純化質(zhì)粒,然后將抽提的重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHI和EcoRI雙酶切和瓊脂糖電泳分析,同時(shí)做測(cè)序鑒定以確定插入的PUMA基因片段準(zhǔn)確無誤。用表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)的質(zhì)粒pYr-2.1-EGFP和表達(dá)紅

4、色熒光蛋白(RFP)的質(zhì)粒pYr-ads—1—RFP檢測(cè)MCF-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)組:空白對(duì)照組、hTERT陰性對(duì)照組、PUMA空載體對(duì)照組、pYr-2.1-hTERT-shRNA組、pYr-ads-1-PUMA組、pYr-2.1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA組,前五組分別以每孔脂質(zhì)體10μl、質(zhì)粒4μg配成轉(zhuǎn)染復(fù)合物,加入各組MCF-7細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染(空白對(duì)照組不加任何試劑),聯(lián)合組每孔pYr-2.1

5、-hTERT-shRNA和pYr-ads-1-PUMA各4μg,脂質(zhì)體20μl。于轉(zhuǎn)染后48h裂解各組細(xì)胞提取總蛋白,通過Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞hTERT、PUMA、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1.重組質(zhì)粒pYr-2.1-hTERT-shRNA經(jīng)SacI酶切鑒定和測(cè)序鑒定證實(shí)目的序列已準(zhǔn)確插入到預(yù)計(jì)位點(diǎn),重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.重組質(zhì)粒pYr-ads-1-PUMA經(jīng)BamHI和Ec

6、oRI雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定證實(shí)目的序列已準(zhǔn)確插入到預(yù)計(jì)位點(diǎn),重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。3.轉(zhuǎn)染后48h熒光顯微鏡下觀察,根據(jù)發(fā)熒光的MCF-7細(xì)胞所占比率判斷LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率約60％。4.免疫印跡Western blot分析顯示:pYr-2.1-hTERT-shRNA組和pYr-2.1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組hTERT蛋白的相對(duì)表達(dá)量與三個(gè)對(duì)照組相比均下降約5

7、2％,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與pYr-ads-1-PUMA組相比下降約53.5％,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而pYr-2.1-hTERT-shRNA組與pYr-2.1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組之間hTERT蛋白表達(dá)差異無顯著性(P>0.05),pYr-ads-1-PUMA組與三個(gè)對(duì)照組相比hTERT蛋白表達(dá)差異無顯著性(P>0.05):pYr-ads-1-PUMA組和pYr-2.

8、1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組PUMA蛋白的相對(duì)表達(dá)量與三個(gè)對(duì)照組相比均增加約145.3％,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與pYr-2.1-hTERT-shRNA組相比增加約147.7％,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而pYr-ads-1-PUMA組與pYr-2.1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組之間PUMA蛋白表達(dá)差異無顯著性(P>0.05),pYr-2.1-hT

9、ERT-shRNA組與三個(gè)對(duì)照組相比PUMA蛋白表達(dá)差異無顯著性(P>0.05):pYr-2.1-hTERT-shRNA組和pYr-2.1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量與三個(gè)對(duì)照組相比均下降約25.1％,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與pYr-ads-1-PUMA組相比下降約24.6％,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而pYr-2.1-hTERT-shRNA組與pYr-2

10、.1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組之間Bcl-2蛋白表達(dá)差異無顯著性(P>0.05),pYr-ads-1-PUMA組與三個(gè)對(duì)照組相比Bcl-2蛋白表達(dá)差異無顯著性(P>0.05)；pYr-2.1-hTERT-shRNA組和pYr-2.1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量與三個(gè)對(duì)照組相比均增加約46.1％,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與pYr-ads-1

11、-PUMA組相比增加約45.2％,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而pYr-2.1-hTERT-shRNA組與pYr-2.1-hTERT-shRNA／pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組之間Bax蛋白表達(dá)差異無顯著性(P>0.05),pYr-ads-1-PUMA組與三個(gè)對(duì)照組相比Bax蛋白表達(dá)差異無顯著性(P>0.05)；pYr-2.1-hTERT-shRNA組、pYr-ads-1-PUMA組、pYr-2.1-hTERT-shRNA／

12、pYr-ads-1-PUMA聯(lián)合組Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量與三個(gè)對(duì)照組相比均下降,各分別下降約23％、43.3％、62.4％,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論:1.成功構(gòu)建了hTERT基因的shRNA表達(dá)載體pYr-2.1-hTERT-shRNA和PUMA基因真核表達(dá)載體pYr-ads-1-PUMA,前者可有效抑制MCF-7細(xì)胞中hTERT蛋白表達(dá),后者可明顯提高PUMA蛋白表達(dá),但hTERT蛋白和PU