血小板衍生生長因子C在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、血小板衍生因子C（PDGF-C）屬于血小板衍生因子（PDGF）家族的一員。在正常細(xì)胞中PDGF-C僅有少量表達(dá)，而在癌癥組織中，PDGF-C表達(dá)增加，且與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。PDGF-C可介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生多種生物學(xué)行為，一般通過結(jié)合其受體PDGFα或β發(fā)揮生物學(xué)功能，有研究表明PDGF-C可以促進(jìn)新生血管的形成，可促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移和增殖。PDGF-C還是一類被大家所認(rèn)可的可以激活成纖維細(xì)胞的細(xì)胞因子。在乳腺癌中，腫瘤組織中表達(dá)有大

2、量的PDGF-C，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，而微環(huán)境中成纖維細(xì)胞上表達(dá)有PDGF-C的受體PDGFα和β，PDGF-C通過與其受體結(jié)合，激活受體，活化的受體導(dǎo)致酪氨酸激酶通路激活，介導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化，參與多種細(xì)胞因子的分泌和細(xì)胞微環(huán)境的形成。
　　越來越多的研究者認(rèn)為腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲不僅取決于腫瘤細(xì)胞本身，而且取決于其所生長的微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)等構(gòu)成。在乳腺癌

3、中，高轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者基質(zhì)組織中存在大量的活化的成纖維細(xì)胞，又稱癌相關(guān)的成纖維細(xì)胞（CAFs）。作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，CAFs與乳腺癌的進(jìn)展息息相關(guān)，CAFs可以分泌多種因子介導(dǎo)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，促進(jìn)乳腺癌的浸潤、增殖和轉(zhuǎn)移。研究者們廣泛認(rèn)同的如SDF-1/CXCR4（基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1/基質(zhì)細(xì)胞衍生因子受體4）生物軸，SDF-1/CXCR4是CAFs分泌的重要因子，CAFs通過分泌SDF-1/CXCR4促進(jìn)腫瘤的定向轉(zhuǎn)移和血

4、管的生成。CAFs還可以通過分泌其他因子來促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，如肝細(xì)胞生長因子的（HGF），表皮生長因子（EGF），堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF），胰島素樣生長因子（IGF）等。CAFs是正常的成纖維細(xì)胞經(jīng)過一些特定的細(xì)胞因子的刺激，使之成為活化的成纖維細(xì)胞（CAFs）。因此阻斷腫瘤微環(huán)境中CAFs的活化過程能阻斷腫瘤的發(fā)展過程。PDGF-C通過與其受體結(jié)合介導(dǎo)成纖維細(xì)胞的活化，因此降低PDGF-C的表達(dá)也可阻止成纖維細(xì)胞的活化。

5、
　　基因序列編碼的蛋白最終得以表達(dá)需通過轉(zhuǎn)錄和翻譯等過程。由于轉(zhuǎn)錄和翻譯的復(fù)雜性，使人類的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)也在多個(gè)層面異常復(fù)雜。其中基因表達(dá)調(diào)控非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)就是轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)的最重要的調(diào)節(jié)點(diǎn)之一就是mRNA的穩(wěn)定性。HuR是研究的最為成熟的一種RNA結(jié)合蛋白，分布于與多種組織中，包括乳腺、脾臟等，HuR通過于mRNA3’UTR區(qū)的AU富集元件結(jié)合激活其功能，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)組前期的研究發(fā)現(xiàn)

6、在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌中表達(dá)有大量的HuR，而低轉(zhuǎn)移性乳腺癌中HuR的表達(dá)水平較低，文獻(xiàn)也有類似的報(bào)道。我們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在PDGF-C mRNA的3’UTR區(qū)存在5個(gè)AU富集元件，可能是HuR的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建PDGF-C mRNA的3’UTR區(qū)載體，轉(zhuǎn)染入HuR高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中，雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)HuR可明顯的增加熒光素酶基因的表達(dá)，且在第2個(gè)和第4個(gè)結(jié)合位點(diǎn)基因表達(dá)增長較明顯，由此可知HuR可

7、作用于PDGF-C mRNA的3’UTR區(qū)調(diào)節(jié)PDGFC。在MDA-MB-231細(xì)胞中，通過siRNA降低HuR的表達(dá)，用western blot技術(shù)檢測在HuR不同表達(dá)水平下PDGF-C表達(dá)水平的變化，研究發(fā)現(xiàn)利用siRNA降低HuR的表達(dá)后，PDGF-C的表達(dá)也降低。說明HuR可以調(diào)節(jié)PDGF-C的表達(dá)，且為正向調(diào)節(jié)。
　　微小RNA（miR）也是通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。miR是一類小的非編碼RNA分子，貫穿癌癥的

8、整個(gè)發(fā)生、發(fā)展過程，多與原癌基因或抑癌基因相關(guān)。miR一般通過結(jié)合靶基因mRNA的3’UTR區(qū)，降解靶基因的mRNA，從而降低靶基因編碼蛋白的表達(dá)。本研究通過生物信息學(xué)分析找出可能作用于PDGF-C mRNA的3’UTR區(qū)的miR，通過與PDGF-C mRNA的3’UTR的熒光載體共同轉(zhuǎn)染入MDA-MB-231細(xì)胞中，培養(yǎng)48小時(shí)后，雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證有生物學(xué)功能的miR，研究發(fā)現(xiàn)在分析軟件分析出的17種miR只有miR-382

9、-5p降低讀數(shù)最明顯；將miR-382-5p類似物轉(zhuǎn)染入MDA-MB-231細(xì)胞中，用western blot技術(shù)檢測PDGF-C的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染入miR-382-5p類似物后PDGF-C的表達(dá)降低。這就證明miR-382-5p可以作用于PDGF-C mRNA的3’UTR區(qū)，降解PDGF-C的mRNA，使PDGF-C表達(dá)下調(diào)。同時(shí)我們利用RT-PCR技術(shù)檢測惡性程度不同的兩種乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-23

10、1與MCF-7細(xì)胞中miR-382-5p表達(dá)情況，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)移性高的MDA-MB-231細(xì)胞中miR-382-5p表達(dá)低，而在轉(zhuǎn)移性低的MCF-7細(xì)胞中miR-382-5p表達(dá)高，符合前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的邏輯。
　　HuR和miR-382-5p都可以作用于PDGF-C的3’UTR區(qū)，且同時(shí)存在與乳腺癌腫瘤組織中。將乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞分為3組，第1組MDA-MB-231細(xì)胞正常培養(yǎng)，第2組給細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-382-5

11、p類似物，第3組轉(zhuǎn)染HuR的siRNA，western blot實(shí)驗(yàn)檢測PDGF-C的表達(dá)差異。研究發(fā)現(xiàn)PDGF-C在第一組表達(dá)最高，第二組稍有降低，第三組顯著降低，說明HuR和miR-382-5p都可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)PDGF-C的表達(dá)，且分別為正向和負(fù)向調(diào)節(jié)。
　　在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，PDGF-C可激活腫瘤微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移。本研究設(shè)計(jì)一系列實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白HuR可作用于PDGF-C mRNA