人血小板衍生生長因子B鏈成熟肽基因克隆及表達.pdf

1、該研究通過分子克隆方法獲取人血小板衍生生長因子B鏈成熟肽基因,構建原核表達載體;利用大腸桿菌體系原核表達人血小板衍生生長因子B鏈前體蛋白,并純化、復性進而獲得具有功能活性的PDGF-BB;并對獲得的重組rhPDGF-BB蛋白進行體外功能活性鑒定,同時,初步探討PDGF-BB在畢赤酵母中的表達,為尋找更優(yōu)化的表達純化方法提供實驗學依據(jù).通過上述研究,為PDGF-BB在骨修復與重建及創(chuàng)傷愈合等方面的進一步功能研究奠定基礎.方法:(1)原代培

2、養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞,收集細胞沉淀,提取臍靜脈內皮細胞總RNA;(2)以血管內皮細胞總RNA為逆轉錄模板,應用一步法RT-PCR進行擴增,獲得PDGF-B<,1>編碼區(qū)cDNA;以RT-PCR產(chǎn)物為模板,利用特異引物進行PCR擴增,所得產(chǎn)物即為PDGF-B<,1>鏈成熟肽全長cDNA;(3)PDGF-B<,1>成熟肽基因與載體pGEM-T連接后進行序列分析;之后與表達質粒pQE-30連接,構建表達載體pQE30-PDGF-B<,1>,雙酶

3、切及PCR鑒定;(4)表達載體pQE30-PDGF-B轉化感受態(tài)大腸桿菌M15,IPTG、37℃誘導表達,15％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析蛋白的表達情況.(5)Wsetern-Blot分析表達的重組蛋白的免疫原性;(6)重組蛋白的純化與復性.大量誘導培養(yǎng)表達菌M15,裂解細菌,洗滌并裂解包涵體,Ni<'2+>-NTA親和層析純化復性PDGF-B.純化后的單體蛋白應用谷胱甘肽還原緩沖體系進行復性,SDS-PAGE分析.(7)重組蛋白體

4、外生物學活性鑒定.體外原代培養(yǎng)SD大鼠成骨細胞,應用rhPDGF-BB對培養(yǎng)中的細胞進行干預,MTT檢測rhPDGF-BB對小鼠成骨細胞增殖活性的影響,流式細胞術(FCM)檢測rhPDGF-BB刺激作用下對大鼠成骨細胞增殖的影響.(8)真核(畢赤酵母)表達載體構建及鑒定.以編碼區(qū)cDNA為模板,利用兩對特異引物進行PCR擴增,分別獲得PDGF-B含信號肽和不含信號肽成熟肽基因片段;分別與酵母表達載體連接,構建PDGF-B的重組表達型質粒

5、載體pMETB-PDGFB2,pMET α A-PDGFB<,3>.結論:PDGF-B成熟肽基因克隆成功并構建了原核表達載體,序列分析及酶切、PCR鑒定符合預期結果;在大腸桿菌中實現(xiàn)了PDGF-B前體蛋白的高表達,并經(jīng)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳和Westem-Blot免疫印跡反應鑒定確認;復性后細胞學MTT和FCM鑒定表明獲得的rhPDGF-BB具有較好的生物學活性,為生產(chǎn)活性PDGF-BB蛋白及其在促進骨組織和創(chuàng)傷修復方面的進