人血小板衍生生長因子B鏈成熟肽基因克隆及表達(dá).pdf

1、該研究通過分子克隆方法獲取人血小板衍生生長因子B鏈成熟肽基因,構(gòu)建原核表達(dá)載體;利用大腸桿菌體系原核表達(dá)人血小板衍生生長因子B鏈前體蛋白,并純化、復(fù)性進(jìn)而獲得具有功能活性的PDGF-BB;并對獲得的重組rhPDGF-BB蛋白進(jìn)行體外功能活性鑒定,同時(shí),初步探討PDGF-BB在畢赤酵母中的表達(dá),為尋找更優(yōu)化的表達(dá)純化方法提供實(shí)驗(yàn)學(xué)依據(jù).通過上述研究,為PDGF-BB在骨修復(fù)與重建及創(chuàng)傷愈合等方面的進(jìn)一步功能研究奠定基礎(chǔ).方法:(1)原代培

2、養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,收集細(xì)胞沉淀,提取臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞總RNA;(2)以血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA為逆轉(zhuǎn)錄模板,應(yīng)用一步法RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增,獲得PDGF-B<,1>編碼區(qū)cDNA;以RT-PCR產(chǎn)物為模板,利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所得產(chǎn)物即為PDGF-B<,1>鏈成熟肽全長cDNA;(3)PDGF-B<,1>成熟肽基因與載體pGEM-T連接后進(jìn)行序列分析;之后與表達(dá)質(zhì)粒pQE-30連接,構(gòu)建表達(dá)載體pQE30-PDGF-B<,1>,雙酶

3、切及PCR鑒定;(4)表達(dá)載體pQE30-PDGF-B轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌M15,IPTG、37℃誘導(dǎo)表達(dá),15％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析蛋白的表達(dá)情況.(5)Wsetern-Blot分析表達(dá)的重組蛋白的免疫原性;(6)重組蛋白的純化與復(fù)性.大量誘導(dǎo)培養(yǎng)表達(dá)菌M15,裂解細(xì)菌,洗滌并裂解包涵體,Ni<'2+>-NTA親和層析純化復(fù)性PDGF-B.純化后的單體蛋白應(yīng)用谷胱甘肽還原緩沖體系進(jìn)行復(fù)性,SDS-PAGE分析.(7)重組蛋白體

4、外生物學(xué)活性鑒定.體外原代培養(yǎng)SD大鼠成骨細(xì)胞,應(yīng)用rhPDGF-BB對培養(yǎng)中的細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),MTT檢測rhPDGF-BB對小鼠成骨細(xì)胞增殖活性的影響,流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測rhPDGF-BB刺激作用下對大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響.(8)真核(畢赤酵母)表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定.以編碼區(qū)cDNA為模板,利用兩對特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別獲得PDGF-B含信號(hào)肽和不含信號(hào)肽成熟肽基因片段;分別與酵母表達(dá)載體連接,構(gòu)建PDGF-B的重組表達(dá)型質(zhì)粒

5、載體pMETB-PDGFB2,pMET α A-PDGFB<,3>.結(jié)論:PDGF-B成熟肽基因克隆成功并構(gòu)建了原核表達(dá)載體,序列分析及酶切、PCR鑒定符合預(yù)期結(jié)果;在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了PDGF-B前體蛋白的高表達(dá),并經(jīng)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳和Westem-Blot免疫印跡反應(yīng)鑒定確認(rèn);復(fù)性后細(xì)胞學(xué)MTT和FCM鑒定表明獲得的rhPDGF-BB具有較好的生物學(xué)活性,為生產(chǎn)活性PDGF-BB蛋白及其在促進(jìn)骨組織和創(chuàng)傷修復(fù)方面的進(jìn)