Notch1信號(hào)系統(tǒng)參與抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)重塑障礙的研究.pdf

1、抑郁癥是最常見(jiàn)的精神障礙疾病，其高死亡率、高致殘率，已成為21世紀(jì)最重要的引起人類殘疾的疾病。有關(guān)抑郁癥的發(fā)病機(jī)理，目前尚無(wú)定論，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者高度關(guān)注神經(jīng)重塑障礙假說(shuō)，臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥的發(fā)生發(fā)展伴隨著海馬神經(jīng)重塑功能障礙，而抗抑郁劑的起效與其逆轉(zhuǎn)神經(jīng)再生有關(guān)。但海馬神經(jīng)再生作為抑郁癥及抗抑郁劑的終靶點(diǎn)，其中涉及的信號(hào)傳導(dǎo)通路尚不明了。Notch信號(hào)通路在成年期動(dòng)物海馬區(qū)持續(xù)表達(dá)，且發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)重塑的作用。癲癇、腦缺血、

2、Alzheimer’s病等疾病狀態(tài)下Notch信號(hào)系統(tǒng)通過(guò)調(diào)節(jié)自身的功能狀態(tài)，調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、神經(jīng)細(xì)胞軸突和樹(shù)突的生長(zhǎng)，對(duì)成年期中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生有重要作用。
　　 抑郁癥的神經(jīng)重塑障礙假說(shuō)和Notch1信號(hào)通路的特性，促使我們深入思考：Notch1信號(hào)系統(tǒng)是否參與慢性應(yīng)激模型大鼠海馬神經(jīng)再生障礙?Notch1信號(hào)系統(tǒng)是否參與氟西汀介導(dǎo)的正常大鼠海馬神經(jīng)再生上調(diào)?Notch1信號(hào)系統(tǒng)在抑郁模型大鼠氟西汀治療前后海馬神經(jīng)再生

3、中的作用?這正是本課題關(guān)注的焦點(diǎn)。立足于抑郁癥深入探討Notch1信號(hào)系統(tǒng)及其神經(jīng)重塑相互作用的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 第一部分：Notch1信號(hào)系統(tǒng)與抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)重塑障礙
　　 目的：了解大鼠抑郁模型中海馬神經(jīng)重塑障礙與Notch1信號(hào)系統(tǒng)功能改變的關(guān)系。
　　 方法：應(yīng)用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激和孤養(yǎng)法建立抑郁模型，分為對(duì)照組、CUMS14d組、CUMS28d組，采用免疫組化、免疫熒光、realti

4、mePCR和Westernblot，測(cè)定大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、存活和分化以及Notch1信號(hào)通路各個(gè)因子(Notch1、Hes1、Hes5、Jag1)的基因及蛋白表達(dá)水平的改變。
　　 結(jié)果：(1)應(yīng)激前各組體重、糖水偏好、曠野試驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳評(píng)分均無(wú)顯著差異(P>0．05)。應(yīng)激14天后，與對(duì)照組相比，CUMS組大鼠體重增長(zhǎng)幅度明顯降低(P<0．05)，糖水偏好顯著降低(P<0．001)，曠野試驗(yàn)中水平得分與垂直得分均顯著降

5、低(P<0．01)，強(qiáng)迫游泳中漂浮不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0．001)。應(yīng)激28天后，與對(duì)照組相比，CUMS組大鼠體重、糖水偏好、曠野實(shí)驗(yàn)水平和垂直得分均顯著降低(P<0．05或P<0．001)，強(qiáng)迫游泳中漂浮不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0．001)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖和存活：與對(duì)照組比較，14dCUMS組和28dCUMS組海馬齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．001)。神經(jīng)干細(xì)胞分化：與對(duì)照組

6、比較，CUMS組NeuN/BrdU、GFAP/BrdU比例無(wú)明顯差異(P>0．05)。(3)與對(duì)照組比較，CUMS背景組隨應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)海馬NICDmRNA、HeslmRNA、Hes5mRNA和Jag1mRNA基因表達(dá)水平明顯降低(P<0．01或P<0．001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，CUMS組海馬NICD、Hes1、Hes5和Jag1蛋白水平均明顯降低(P<0．01或P<0．001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：

7、應(yīng)用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激和孤養(yǎng)法建立模型成功模擬抑郁狀態(tài)；抑郁大鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖和存活受到抑制，分化無(wú)改變；同時(shí)，大鼠海馬Notch1功能下調(diào)。提示Notch1信號(hào)系統(tǒng)可能參與慢性應(yīng)激模型大鼠海馬神經(jīng)再生障礙。
　　 第二部分：Noteh1信號(hào)系統(tǒng)與氟西汀介導(dǎo)的正常大鼠海馬神經(jīng)再生的上調(diào)
　　 目的：了解慢性氟西汀干預(yù)正常大鼠所導(dǎo)致的海馬神經(jīng)再生上調(diào)與Notch1信號(hào)系統(tǒng)功能改變的關(guān)系。
　　 方法：應(yīng)

8、用大鼠腹腔注射氟西汀建立在體模型，分為對(duì)照組、14天干預(yù)組、28天干預(yù)組，采用免疫組化、realtimePCR和Westernblot，測(cè)定大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、存活和分化以及Notch1信號(hào)通路各因子(Notch1、Hes1、Hes5、Jag1)的基因及蛋白表達(dá)水平的改變。
　　 結(jié)果：(1)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和存活：與對(duì)照組比較，14d和28d氟西汀干預(yù)組海馬齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均增加(P<0．001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

9、。神經(jīng)干細(xì)胞分化：與對(duì)照組比較，氟西汀干預(yù)組NeuN/BrdU、GFAP/BrdU比例無(wú)明顯差異(P>0．05)。(2)與對(duì)照組比較，F(xiàn)lu組隨氟西汀干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)NICDmRNA、Hes1mRNA、Hes5mRNA和Jag1mRNA基因表達(dá)明顯增加(P<0．01或P<0．001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，F(xiàn)lu組NICD、Hes1和Jag1蛋白水平明顯升高(P<0．01，P<0．05或P<0．001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但He

10、s5蛋白水平無(wú)改變(P>0．05)。
　　 結(jié)論：氟西汀促進(jìn)大鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和存活，但對(duì)分化無(wú)影響；同時(shí)，海馬Notch信號(hào)功能激活，提示Notch1信號(hào)系統(tǒng)可能參與氟西汀介導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)再生上調(diào)。
　　 第三部分：Noteh1信號(hào)系統(tǒng)在氟西汀逆轉(zhuǎn)抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)重塑中的作用
　　 目的：利用抑郁大鼠模型探討Notch1信號(hào)系統(tǒng)在海馬神經(jīng)再生障礙中的作用。
　　 方法：應(yīng)用慢性不可預(yù)知

11、溫和應(yīng)激建立抑郁模型，分為對(duì)照組、對(duì)照+Flu組、CUMS組，CUMS+Flu組，采用免疫組化、realtimePCR和Westernblot，測(cè)定大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、存活以及Notch1信號(hào)通路各個(gè)因子(NICD、Hes1、Hes5、Jag1)的基因及蛋白表達(dá)水平的改變。
　　 結(jié)果：(1)干預(yù)前各組體重、糖水偏好、曠野試驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳評(píng)分均無(wú)顯著差異(P>0．05)。干預(yù)后，與對(duì)照組相比，CUMS組糖水偏好、水平得分和垂

12、直得分明顯降低，大鼠漂浮不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0．001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CUMS組比較，CUMS+Flu組糖水偏好、水平得分和垂直得分明顯增加，大鼠漂浮不動(dòng)時(shí)間顯著降低(P<0．01或P<0．001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各組間體重差異不顯著(P>0．05)。(2)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖：與CUMS組比較，CUMS+Flu組海馬齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0．001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；神經(jīng)干細(xì)胞的存活：與CUMS組比較，CU

13、MS+Flu組海馬齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0．001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)CUMS+Flu組NICD、Hes1、Hes5和Jag1的基因表達(dá)水平較CUMS組顯著上升(P<0．001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CUMS+Flu組的NICD、Hes5和Jag1蛋白水平較CUMS組顯著上升(P<0．001)，但Hes1的蛋白水平無(wú)明顯上升(P>0．05)。
　　 結(jié)論：(1)Notch1信號(hào)系統(tǒng)可能參與慢性應(yīng)激模型大鼠海

14、馬神經(jīng)再生障礙；(2)氟西汀通過(guò)上調(diào)Notch1信號(hào)系統(tǒng)改善海馬神經(jīng)再生，從而緩解大鼠抑郁癥狀。
　　 第四部分：Notch1信號(hào)通路在氟西汀調(diào)控胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖中的作用
　　 目的：探討Notch1信號(hào)系統(tǒng)在氟西汀促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)增殖中的作用。
　　 方法：不同濃度的氟西汀干預(yù)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞，通過(guò)四甲基偶氮唑鹽法(MTT)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞活力的影響，獲取最適作用濃度。分別予Notch1信號(hào)通路抑制

15、劑DAPT和氟西汀干預(yù)神經(jīng)干細(xì)胞后，采用MTT檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，RealtimePCR、Westernblot法檢測(cè)Notch信號(hào)各因子的基因和蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)氟西汀濃度超過(guò)40μmol/L濃度時(shí)，可降低NSCs活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01或P<0．05)；(2)不同濃度的氟西汀干預(yù)細(xì)胞48h后，10μmol/L/、15μmol/L和20μmol/L組NSCs的活性高于0μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

16、(P<0．01)；(3)與對(duì)照組相比，氟西汀組的細(xì)胞活性增高，DAPT組的活性降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．001)。與氟西汀干預(yù)組相比，氟西汀+DAPT組細(xì)胞活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．001)；(4)與對(duì)照組相比，DAPT組Hes1和Hes5蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0．001，P<0．05)；與對(duì)照組相比，氟西汀組NICD、Hes1和Hes5蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0．001，P<0．05orP<0．01)；與氟西汀