兔同種異體脫鈣骨復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞關(guān)節(jié)腔內(nèi)培養(yǎng)軟骨與同腔軟骨的性狀對比研究.pdf

1、目的采用兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)復(fù)合同種異體脫鈣骨(DBM)體外培養(yǎng)和關(guān)節(jié)腔內(nèi)培養(yǎng)組織工程軟骨與同腔軟骨的性狀對比研究。
　　方法1.采用同源雄性新西蘭幼兔(4~6周齡)全骨髓貼壁篩選法培養(yǎng)原代BMSC,第三代細(xì)胞融合至約80％時培養(yǎng)基中加入成軟骨誘導(dǎo)液:含轉(zhuǎn)化生長因子(TransformingGrowthFactor,TGF)-β110ng/ml、胰島素樣生長因子(Insulin-likeGrowthFactor,IGF)

2、-120ng/ml、維生素C50ng/ml。2.根據(jù)Urist提供的方法制作DBM并做掃描電鏡(SEM)觀察。3.將誘導(dǎo)后的BMSC種植于30個DBM支架培養(yǎng)并分別在體外(A組)及關(guān)節(jié)腔內(nèi)(B組)培養(yǎng)。于4、8、12周分別取材,同時取同腔軟骨(C組)作為對照,行SEM等大體形態(tài)觀察并制石蠟切片行蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin-EosinStaining,HE)、甲苯胺藍(lán)(ToluidineBlue,TB)染色、Masson三色

3、染色、Ⅱ型膠原免疫組化等組織學(xué)觀察并進(jìn)行比較。
　　結(jié)果1.本實驗方法分離和培養(yǎng)的BMSC形態(tài)特征明顯,呈長梭形,原代培養(yǎng)10~12天細(xì)胞融合約90%,增殖傳代的細(xì)胞6~7天可達(dá)約90%融合。2.BMSC經(jīng)定向誘導(dǎo)后表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞的特性。3.制備得到的DBM為三維立體疏松多孔的海綿樣結(jié)構(gòu)。4.A、B、C三組培養(yǎng)12w后,取出標(biāo)本行SEM等大體觀察、組織學(xué)切片觀察及Ⅱ型膠原免疫組化檢測:A組:SEM:標(biāo)本表面凹凸不平,內(nèi)部尚有部分空

4、隙;HE染色見軟骨細(xì)胞少量增生,胞核藍(lán)染;甲苯胺藍(lán)染色見軟骨細(xì)胞排列無序,少量周圍基質(zhì)包繞;Masson染色陽性區(qū)域小,細(xì)胞排列無序;Ⅱ型膠原免疫組化見軟骨細(xì)胞胞漿及胞外基質(zhì)少量黃色顆粒。B組:SEM:標(biāo)本表面較光滑;HE染色見軟骨細(xì)胞增生,胞核藍(lán)染;甲苯胺藍(lán)染色見軟骨細(xì)胞成串排列,軟骨陷窩形成,周圍基質(zhì)包繞;Masson染色陽性,軟骨細(xì)胞多,基質(zhì)藍(lán)染,按一定應(yīng)力方向排列;Ⅱ型膠原免疫組化見細(xì)胞外基質(zhì)中出現(xiàn)較多棕黃色顆粒,Ⅱ型膠原染色陽