尿硫酸化膽汁酸代謝輪廓分析用于妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥的診斷和分度.pdf

1、背景:
　　妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)是妊娠中晚期特有的肝臟疾病。其發(fā)病有種族與地域的差異。ICP最主要的后果是對胎兒產(chǎn)生的危害，如圍產(chǎn)兒死亡、胎兒宮內(nèi)窘迫、早產(chǎn)、新生兒窒息、羊水胎糞污染等。ICP發(fā)病機理尚不明確，具有家族性、復(fù)發(fā)性特點。ICP目前還無公認的統(tǒng)一的診斷和分度標準。臨床在治療ICP時面臨兩難的境地。如果漏診（重度漏診為輕度ICP），則很有可能發(fā)生“難以預(yù)料的胎兒宮內(nèi)死亡”;如果發(fā)生誤診（輕度誤診為重度ICP），

2、則使剖宮產(chǎn)的發(fā)生率上升和治療性早產(chǎn)的增加，導(dǎo)致一些沒有必要的醫(yī)療費用的增高、以及醫(yī)療資源的不合理浪費等現(xiàn)象。實驗室檢查在ICP的診斷中起著不可或缺的作用。血清中總膽汁酸的檢測是診斷ICP的十分重要的指標，但僅僅血清膽汁酸指標仍不夠特異和靈敏，也受到其他諸多因素的影響。眾多學(xué)者研究了血清膽汁酸代謝產(chǎn)物對ICP的診斷應(yīng)用價值，雖然給臨床提供了一定的有價值的信息，但至今仍缺乏公認的能有效進行ICP診斷和鑒別診斷的檢測指標。尿硫酸化的膽汁酸是膽

3、汁酸的主要清除形式，特別是在肝膽疾病的情況下。蓄積體內(nèi)的膽汁酸硫酸化后水溶性增加，更易于被腎臟清除，從而減少高濃度非硫酸化膽汁酸所造成的肝臟損傷。ICP病人主要特征是肝內(nèi)膽汁淤積，因而，檢測尿中硫酸化膽汁酸可能對ICP的診斷和分度具有重要的價值。近年來發(fā)展起來的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測靈敏度高，特異性好，是檢測尿硫酸化膽汁酸的理想方法，使全面了解ICP患者尿液硫酸化膽汁酸組分的變化成為可能。
　　目的:

4、　　采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對三類人群（正常孕婦、輕度ICP與重度ICP患者）的尿硫酸化膽汁酸進行代謝輪廓分析。研究三類人群尿硫酸化膽汁酸代謝輪廓、血清生化指標的變化情況，尋找潛在的有價值的可用于ICP診斷和分度的尿硫酸化膽汁酸標志物，為臨床對ICP進行正確診斷和分度提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測尿硫酸化膽汁酸方法學(xué)研究
　　通過硫酸化石膽酸(3 S-LCA)、硫酸化?；鞘懰?3S-TLCA

5、)和硫酸化甘氨石膽酸(3S-GLCA)三種硫酸化膽汁酸標準品質(zhì)譜條件的優(yōu)化，探索硫酸化膽汁酸的最佳離子化參數(shù)。根據(jù)硫酸化膽汁酸的性質(zhì)選擇合適的流動相、色譜柱，并測試不同條件下的梯度洗脫方式，探索最佳的色譜條件。考察不同條件下的尿液樣品處理方式，探索和優(yōu)化尿液樣品的處理條件。在已優(yōu)化的色譜、質(zhì)譜及樣品處理條件基礎(chǔ)上，研究和探索檢測尿中硫酸化膽汁酸的最佳質(zhì)譜條件，并通過回收試驗、精密度試驗、靈敏度、檢測線性等評估所建立的方法學(xué)的性能。

6、>　　2.ICP病人尿硫酸化膽汁酸代謝輪廓分析
　　根據(jù)現(xiàn)有的ICP病人診斷與分度標準，收取18例正常孕婦、20例輕度ICP病人、23例重度ICP病人尿液標本。使用LC-MS/MS檢測三類人群（正常孕婦、輕度ICP、重度ICP）的尿硫酸化膽汁酸，通過代謝輪廓分析的方法，尋找對ICP診斷和分度有潛在價值的尿硫酸化膽汁酸標志物。
　　結(jié)果:
　　1.建立了HPLC-MS/MS分析尿硫酸化膽汁酸代謝輪廓的方法。樣品采用OAS

7、IS HLB柱固相萃取，經(jīng)luna C18(150 mm×2.00 mm，3μm)色譜柱分離，柱溫40℃，流動相組成為:A為含0.1％甲酸和2 mmol/L乙酸銨甲醇溶液;B為含0.1％甲酸和2 mmol/L乙酸銨乙腈溶液，流速0.2ml/min，梯度洗脫，使用電噴霧離子源(ESI），負離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM）檢測。
　　2.每個樣本的分析時間為18 min。3S-TLCA、3S-LCA及3S-GLCA線性范圍分別為9.

8、7-998.0 ng/ml，9.0-1080.0 ng/ml，9.3-1123.3 ng/ml,相關(guān)系數(shù)達到0.999。3S-LCA,3S-GLCA和3S-TLCA的檢測限均為5ng/ml。日內(nèi)精密度均小于4.0％，日間精密度均小于5.0％。三種硫酸化膽汁酸的回收率在89.4-100.7％范圍內(nèi)。
　　3.血清中甘膽酸(CG)、總膽汁酸(TBA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)在輕度ICP和重度ICP均較正常孕婦顯著升

9、高。堿性磷酸酶(ALP)在三個組均升高，但無顯著差別。直接膽紅素(DBIL)和總膽紅素(TBIL)在重度ICP組比正常孕婦組顯著升高。
　　4.與正常孕婦相比，總硫酸化膽汁酸在輕度和重度ICP組分別增高4.0倍(p＜0.017)和9.0倍(p＜0.017)。其中硫酸化甘氨結(jié)合型膽汁酸(Total3S-Glyco BA)和硫酸化牛磺結(jié)合型膽汁酸(Total3S-TauroBA)，分別增加3.2倍和4.5倍（輕度ICP組），11.6倍

10、和23.2倍(p＜0.017，重度ICP組)。3S-Tauro BA/3S-Glyco BA在正常孕婦組、輕度ICP組和重度ICP組分別為44.8％、62.1％和89.5％。與其他硫酸化膽汁酸相比，硫酸化未結(jié)合膽汁酸在正常孕婦組、輕度ICP組和重度ICP組的含量均較低。3S-LCA在所有硫酸化膽汁酸中含量最少。在尿各種硫酸化膽汁酸中，甘氨結(jié)合型及?；撬峤Y(jié)合型的硫酸化膽汁酸是最主要的成份，占總硫酸化膽汁酸的90％以上。尿中3S-GCA,3

11、S-TCA,3S-CA,3S-TLCA和3S-TDCA/3S-TCDCA/3S-TUDCA在重度ICP組較正常孕婦組顯著升高。
　　5.主成份分析(PCA)表明重度ICP和正常孕婦能夠區(qū)分開，而輕度ICP基本上和重度ICP及正常孕婦分開。通過偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)，用該模型診斷正常孕婦的正確率為88.9％，診斷重度ICP的正確率為90.0％。
　　結(jié)論:
　　本研究建立了HPLC-MS/MS分析尿硫酸化膽