非小細(xì)胞肺癌PBK-TOPK與Ki-67及p53表達(dá)的關(guān)系及預(yù)后意義.pdf

1、研究背景:
　　 近年的研究表明肺癌已成為世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80％～85％。一直以來(lái)，對(duì)肺癌的早期診斷及治療缺乏有效的手段，手術(shù)切除、化療和放療是非小細(xì)胞肺癌患者治療的主要方式。然而，患者術(shù)后的生存情況并不理想，5年的生存率不足20％，腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)決定著患者術(shù)后的生存。因此，研究與肺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)志物，探討其作用機(jī)制對(duì)肺癌的早期診斷、治療及預(yù)后評(píng)估具有極其重要的意

2、義。
　　 PBK/TOPK(PDZ-binding kinase/T-LAK cell-originated protein kinase)是一種新穎的蛋白激酶，最早于淋巴因子激活的殺傷性T細(xì)胞(T-LAK)中發(fā)現(xiàn)，具有322個(gè)氨基酸，與惡性腫瘤的增殖調(diào)控密切相關(guān)，在惡性腫瘤中呈高表達(dá)，除正常睪丸組織和一些胚胎組織外，其它正常組織中均難以檢測(cè)到其表達(dá)。
　　 Ki-67是一種較為常見(jiàn)的細(xì)胞增殖標(biāo)記物，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于臨床病

3、理診斷中。p53基因是一種抑癌基因，分為野生型及突變型兩種亞型，其中野生型p53可調(diào)節(jié)DNA的修復(fù)及細(xì)胞的凋亡，突變型p53與腫瘤的形成密切相關(guān)。關(guān)于PBK/TOPK在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制是否與Ki-67及p53有關(guān)，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，為此我們進(jìn)行了研究。
　　 研究目的及內(nèi)容:
　　 1.探討PBK/TOPK在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其預(yù)后意義;
　　 2.探討PBK/TOPK與Ki-67及p53在非小細(xì)胞肺癌中

4、表達(dá)的相關(guān)性及其預(yù)后意義;
　　 3.探討PBK/TOPK下調(diào)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移、增殖及存活能力的影響;
　　 4.探討PBK/TOPK在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)與Ki-67及p53的關(guān)系;
　　 材料及方法:
　　 1.PBK/TOPK在正常肺組織、肺良性病變、非小細(xì)胞肺癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)及其預(yù)后意義分析
　　 免疫組化SP法檢測(cè)30例正常成人肺組織、30例肺良性病變、279例非

5、小細(xì)胞肺癌原發(fā)灶及32例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中PBK/TOPK蛋白的表達(dá);用計(jì)算機(jī)ImageproPlus6.0(IPP)圖像分析軟件定量測(cè)試蛋白表達(dá)的陽(yáng)性單位（PU值），結(jié)合臨床相關(guān)病理資料及隨訪資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及術(shù)后生存分析。
　　 2.PBK/TOPK與Ki-67及p53在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的相關(guān)性及其預(yù)后意義分析
　　 免疫組化SP法檢測(cè)279例非小細(xì)胞肺癌組織中PBK/TOPK、Ki-67及p53蛋白的表達(dá)，采用半定

6、量方法對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析，探討PBK/TOPK蛋白與Ki-67及p53蛋白表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)合臨床相關(guān)病理資料及隨訪資料進(jìn)行術(shù)后生存分析。
　　 半定量分析方法及參考標(biāo)準(zhǔn):陰性:無(wú)色或淡黃色;陽(yáng)性:棕黃色或棕褐色;分別統(tǒng)計(jì)PBK/TOPK、Ki-67及p53在非小細(xì)胞肺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的百分比，取其平均值作為半定量判定的臨界值。
　　 3.PBK/TOPK下調(diào)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移、增殖及存活能力的影響
　　

7、 實(shí)驗(yàn)分為干擾組和對(duì)照組，選用PBK/TOPK高表達(dá)的A549和GLC-82兩株腺癌細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行。干擾組采用siRNA干擾片段對(duì)兩株細(xì)胞中PBK/TOPK的表達(dá)進(jìn)行干擾，使PBK/TOPK表達(dá)明顯下調(diào)，對(duì)照組未進(jìn)行任何處理。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PBK/TOPK下調(diào)后細(xì)胞的遷移能力，同時(shí)采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法及臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)PBK/TOPK下調(diào)后細(xì)胞的增殖及存活能力。
　　 4.PBK/TOPK

8、在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)與Ki-67及p53的關(guān)系
　　 采用四株肺癌細(xì)胞，其中包括3株肺腺癌細(xì)胞（A549、GLC-82和H358）及1株大細(xì)胞肺癌細(xì)胞(H460)，通過(guò)熒光定量PCR(QRT-PCR)、免疫印跡(Western blot)及細(xì)胞滴片免疫組化法檢測(cè)四種細(xì)胞株中PBK/TOPK和p53的表達(dá)。同時(shí)采用細(xì)胞滴片免疫組化法檢測(cè)Ki-67蛋白的表達(dá)，采用IPP圖像分析軟件定量檢測(cè)蛋白表達(dá)的陽(yáng)性單位（PU值）。對(duì)PBK

9、/TOPK表達(dá)較高的兩株細(xì)胞株進(jìn)行siRNA干擾，采用QRT-PCR和Western blot驗(yàn)證其干擾效率，再分別檢測(cè)Ki-67及p53的表達(dá)，探討PBK/TOPK下調(diào)是否會(huì)影響Ki-67及p53的表達(dá)。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩樣本均數(shù)間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，若方差齊，組間多重比較采用LSD，若方差不齊，組間的多重比較采用Dunn

10、ett's T3檢驗(yàn)。采用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行相關(guān)分析。術(shù)后總體生存率的比較采用Pearsonx2檢驗(yàn)，利用Kaplan-Meier法log rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素生存分析，多因素生存分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。
　　 結(jié)果:
　　 1.PBK/TOPK在正常肺組織、肺良性病變、非小細(xì)胞肺癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)及其預(yù)后意義分析
　　 免疫組化定量分析表明PBK/TOPK在正常肺組織、肺良性病變、

11、非小細(xì)胞肺癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)差異具有非常的顯著性(P=0.000)，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中PBK/TOPK表達(dá)的PU值高于原發(fā)灶、肺良性病變及正常肺組織。PBK/TOPK在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)（P值分別為0.027、0.000、0.000、0.000），而與其它臨床病理特征無(wú)明顯相關(guān)（P＞0.05）。
　　 免疫組化半定量分析結(jié)果顯示PBK/TOPK在正常肺組織、肺良性病

12、變及非小細(xì)胞肺癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的高表達(dá)率分別為:0％、0％、44.8％、75％，組內(nèi)比較差異具有非常的顯著性(P=0.000)。Kaplan-Meier單因素生存分析結(jié)果表明PBK/TOPK蛋白的表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后有關(guān)(P值均為0.000)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析表明PBK/TOPK的表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期是影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后評(píng)價(jià)的因素(P值分別為0.000、0.009

13、、0.022)。
　　 2.PBK/TOPK與Ki-67及p53在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的相關(guān)性及其預(yù)后意義分析
　　 在279例非小細(xì)胞肺癌原發(fā)灶組織中PBK/TOPK、Ki-67與p53的高表達(dá)率分別為44.8％、64.9％、49.1％。PBK/TOPK與Ki-67及p53的表達(dá)均具有正相關(guān)性（r=0.249，P=0.000; r=0.153，P=0.000）。
　　 在本研究中PBK/TOPK、Ki-67及p5

14、3蛋白高表達(dá)患者的5年生存率分別為:12.4％、18.2％、21.2％。單因素生存分析結(jié)果表明PBK/TOPK蛋白、Ki-67蛋白及p53蛋白的表達(dá)均與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后有關(guān)(P值分別為0.000、0.000、0.003)。PBK低/Ki-67低患者的術(shù)后中位生存期明顯高于PBK低/Ki-67高及PBK高/Ki-67高患者（P=0.029; P=0.000）;PBK低/p53低患者的術(shù)后中位生存期明顯高于PBK高/p53低及PBK高

15、/p53高患者（P=0.001; P=0.000）。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型的多因素分析表明PBK/TOPK、Ki-67及p53的表達(dá)均可作為影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后評(píng)估的因素(P值分別為0.000、0.015、0.034)。
　　 3.PBK/TOPK下調(diào)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移、增殖及存活能力的影響
　　 經(jīng)siRNA干擾后，GLC-82及A549細(xì)胞中的PBK/TOPKmRNA表達(dá)水平下調(diào)分別約83.6％、69.9％。

16、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PBK/TOPK下調(diào)可明顯抑制細(xì)胞的遷移。其中，在A549與GLC-82細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)中，干擾組細(xì)胞的遷移距離顯著低于對(duì)照組（P值分別為0.006、0.000）。在A549與GLC-82細(xì)胞的Transwell實(shí)驗(yàn)中，干擾組的細(xì)胞遷移數(shù)量也明顯低于對(duì)照組(P值均為0.000)。
　　 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PBK/TOPK下調(diào)可抑制細(xì)胞的增殖。在A549與GLC-82細(xì)胞中，干擾組細(xì)胞的增殖能

17、力明顯低于對(duì)照組，干擾48小時(shí)后差異較為明顯（P值均為0.000）。
　　 臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果表明PBK/TOPK下調(diào)可降低細(xì)胞的存活能力。在A549與GLC-82細(xì)胞中，干擾組與對(duì)照組相比，PBK/TOPK下調(diào)后細(xì)胞的存活率均明顯降低（P值分別為0.002、0.005）。
　　 4.PBK/TOPK在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)與Ki-67及p53的關(guān)系
　　 經(jīng)QRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PBK/TOPK mRNA在A54

18、9、GLC-82、H358及H460四株肺癌細(xì)胞中均有表達(dá)，其中在H358及GLC-82細(xì)胞中表達(dá)較高，在A549及H460細(xì)胞中表達(dá)較低。Western blot及細(xì)胞滴片免疫組化檢測(cè)結(jié)果均表明PBK/TOPK蛋白在H358及GLC-82細(xì)胞中表達(dá)較高，在A549及H460細(xì)胞中表達(dá)較低。PBK/TOPK蛋白在四種細(xì)胞中表達(dá)的PU值比較，差異具有顯著性(P=0.000)。
　　 經(jīng)QRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)突變型p53mRNA在A

19、549、GLC-82、H358及H460四種肺癌細(xì)胞中均有表達(dá)，其中在H358、H460及A549細(xì)胞中表達(dá)較高，在GLC-82細(xì)胞中表達(dá)較低;Western blot及細(xì)胞免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明p53蛋白在H358、H460及A549細(xì)胞中表達(dá)較高，在GLC-82細(xì)胞中表達(dá)較低。p53蛋白在四種細(xì)胞中表達(dá)的PU值比較，差異具有非常的顯著性(P=0.000)。
　　 細(xì)胞滴片免疫組化檢測(cè)Ki-67蛋白在四種肺癌細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表

20、明Ki-67在四種細(xì)胞中均呈高表達(dá)，PU值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 將高表達(dá)PBK/TOPK的A549及GLC-82細(xì)胞分別經(jīng)siRNA干擾，PBK/TOPK表達(dá)明顯下調(diào)，A549和GLC-82細(xì)胞中PBK/TOPK mRNA下調(diào)分別為69.9％、83.6％，檢測(cè)突變型p53mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PBK/TOPK下調(diào)可促使其下調(diào)，其中在A549和GLC-82細(xì)胞中p53mRNA表達(dá)下調(diào)分別為74.5％、68.

21、5％，p53蛋白表達(dá)水平也下調(diào)。細(xì)胞滴片免疫組化檢測(cè)表明PBK/TOPK下調(diào)后A549和GLC-82細(xì)胞中Ki-67蛋白表達(dá)水平也出現(xiàn)了明顯下調(diào)，與對(duì)照組相比，PU值明顯減?。≒值均為0.000）。
　　 結(jié)論:
　　 1.PBK/TOPK的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的形成及轉(zhuǎn)移有關(guān);PBK/TOPK在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，其表達(dá)可作為影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后評(píng)估的要素。

22、　　 2.PBK/TOPK與Ki-67及p53在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)均呈正相關(guān)性，PBK高/Ki-67高及PBK高/p53高的患者預(yù)后較差。
　　 3.Ki-67及p53的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后不良相關(guān)，均可作為影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后評(píng)估的要素。
　　 4.PBK/TOPK具有促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移、增殖及存活的能力。
　　 5.PBK/TOPK在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制與Ki-67及p53密切相關(guān)。