腎癌中EZH2表達(dá)的臨床意義及靶向EZH2的siRNA對腎癌ACHN細(xì)胞影響的實驗研究.pdf

1、研究背景:腎癌又稱腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是臨床最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，占到了所有成人惡性腫瘤的2-3％。在西方國家其發(fā)病率較高，在歐洲每年一般較上一年有2％的增幅，這與一些能夠發(fā)現(xiàn)無癥狀RCC的先進(jìn)檢查技術(shù)的應(yīng)用及人們對RCC認(rèn)識的加深有著一定的關(guān)系。盡管在一些北歐國家如瑞典和丹麥，RCC發(fā)病率維持穩(wěn)定甚至有小幅的下降，但是在其他的歐洲國家，其發(fā)病率仍呈現(xiàn)增長趨勢。在我國泌尿外科惡性腫瘤發(fā)病率

2、中，RCC僅次于膀胱癌，占第二位。60到70歲之間是RCC的發(fā)病高發(fā)年齡段，其男女患者性別比為3∶2。其發(fā)病原因與吸煙，高血壓、高血脂都有一定程度的關(guān)系。因為腎在體內(nèi)位置比較隱蔽，加之臨床癥狀多變，RCC難以早期發(fā)現(xiàn)，約有半數(shù)的腎癌是偶然發(fā)現(xiàn)的。典型的腎癌三聯(lián)征（腰痛、肉眼血尿及腰腹部包塊）僅見于約6-10％的RCC患者。RCC確診時約35％的患者已有淋巴轉(zhuǎn)移，而一旦出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，即使行腎癌根治術(shù)，患者生存期也極少超過5年，RCC患者若出現(xiàn)

3、肝肺骨等遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移則預(yù)后更差。RCC對放、化療均不敏感，因此RCC的常規(guī)輔助治療不包括放、化療等治療。新的治療手段如基因靶向治療等雖有望成為治愈RCC的有效治療方法之一，但是目前最突出的問題是缺乏理想而可靠的治療標(biāo)靶。因此尋找調(diào)控RCC基因治療的分子標(biāo)靶，明確其在RCC發(fā)生發(fā)展過程中的機制，已逐漸成為目前研究工作的重點和熱點。
　　 EZH2(enhancer ofzeste homolog2)基因與果蠅zeste基因增強子(

4、E(z))是同源基因，是聚硫蛋白復(fù)合物基因家族(polycomb group，PcG)中的一員，是一種進(jìn)化上高度保守的基因。PcG家族和與其有著拮抗作用的Trithorax group(TrxG)基因家族都是在進(jìn)化過程中保守的染色質(zhì)修飾基因，他們共同調(diào)控同源異形基因(homeotic gene)的沉默和活化，其中同源異形基因的激活由TrxG蛋白決定，而PcG蛋白則維持基因的失活狀態(tài)。1996年，EZH2基因最早由Chen等人研究Down

5、氏綜合癥致病基因位點的毗鄰基因時發(fā)現(xiàn)。有研究表明EZH2可抑制正常細(xì)胞中的抑癌基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖，并且能夠刺激腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與擴散。近年來越來越多的研究證實人EZH2蛋白和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶功能有相關(guān)性，通過后者參與了DNA甲基化;還有部分學(xué)者認(rèn)為由于EZH2可抑制抑癌基因的表達(dá)，因此其可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中基因表達(dá)的異常。由此可推斷EZH2可能成為一種新的腫瘤標(biāo)志物。
　　 RNA干擾(RNAi)最先由Fire等在19

6、98年提出，具有特異性強、作用效率高、干擾作用可擴散及操作簡單等優(yōu)點，對目的基因有著很強的抑制作用。轉(zhuǎn)錄后抑制是RNAi的主要機制，其作用過程可基本上分為啟動階段和效應(yīng)階段，所使用的轉(zhuǎn)染表達(dá)載體包括質(zhì)粒、病毒和人造載體等?；蛲怙@子序列是RNAi的作用靶點位，尤其是保守序列其干擾效果最好;而其對基因的啟動子、內(nèi)含子和終止子等序列無干擾作用。通過RNAi對腎癌細(xì)胞EZH2基因的沉默，我們希望能夠找到以下問題的答案:EZH2基因在RCC發(fā)生

7、發(fā)展中的作用如何？其與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的關(guān)系如何？其機制可能是什么？關(guān)于這系列問題目前尚無系統(tǒng)研究與相應(yīng)報告。
　　 基于此目的和背景，本研究擬進(jìn)行:
　　 1.EZH2在人RCC組織及RCC細(xì)胞系A(chǔ)CHN中的表達(dá)及意義;
　　 2.靶向EZH2的siRNA真核干預(yù)載體的構(gòu)建;
　　 3.在RCC細(xì)胞株ACHN利用siRNA敲減EZH2，了解其對RCC細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲力的影響;
　　

8、 4.探討干擾EZH2對腎癌ACHN細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞信號通路表達(dá)的影響。
　　 第一部分EZH2在人腎癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)水平的研究
　　 目的:1.研究EZH2在RCC組織和“正?！蹦I臟組織中的表達(dá)情況及意義;2.研究EZH2基因mRNA及EZH2蛋白在人腎癌細(xì)胞株ACHN及成人正常腎近曲小管上皮細(xì)胞株HK-2中的表達(dá)情況，作為后續(xù)實驗基礎(chǔ)。
　　 方法:1.應(yīng)用S-P免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測66例RCC及8例對照標(biāo)本

9、為腎臟外傷后切除的腎臟（病理證實為正常腎臟組織）組織中的EZH2表達(dá)，并結(jié)合標(biāo)本來源患者的臨床和病理資料進(jìn)行分析;2.采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-Ploymerase chainreaction，RT-PCR)檢測人腎癌細(xì)胞株ACHN及人正常腎近曲小管上皮細(xì)胞株HK-2中EZH2基因mRNA含量，免疫印記Western Blot分別檢測細(xì)胞株ACHN和HK-2中的EZH2蛋白含量。
　　

10、 結(jié)果:1.66例RCC組織中EZH2蛋白的表達(dá)情況:陽性48例，陰性18例，陽性率為72.7％;8例“正?！蹦I臟組織中EZH2蛋白的表達(dá)情況:陽性1例，陰性7例，陽性率為12.5％，兩者比較RCC中EZH2蛋白陽性率明顯高于“正?！蹦I臟組織，P=0.002。2.EZH2在RCC組織中的表達(dá)與腫瘤的臨床Robson分期、腫瘤直徑大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、腎癌的病理類型相關(guān)(P＜0.05);而與患者年齡、性別、病理Fuhrman分級無相關(guān)性(

11、P＞0.05)。3.RT-PCR檢測EZH2條帶顯影定位于193bp處，內(nèi)參GAPDH條帶顯影定位于450bp處。根據(jù)所測得IOD比值計算(IODEZH2/IODGAPDH)，ACHN細(xì)胞株EZH2基因mRNA含量（0.648±0.003）明顯高于HK-2細(xì)胞株（0.333±0.025），表達(dá)差異具有顯著性(P＜0.01)。4.Western blot檢測EZH2條帶顯影定位于80KD處，內(nèi)參GAPDH條帶顯影定位于37KD處。根據(jù)所測

12、得IOD比值計算(IODEZH2/IODGAPDH)，ACHN細(xì)胞株EZH2蛋白表達(dá)（0.290±0.009）明顯高于HK-2細(xì)胞株（0.136±0.012），表達(dá)差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:1.EZH2在RCC組織中明顯高表達(dá)，并且與腫瘤的臨床分期相關(guān)，提示其與RCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，對于人RCC的早期診斷及預(yù)后判斷可能有重要的意義;2.人腎癌細(xì)胞株ACHN中EZH2基因mRNA含量和EZH2蛋白含量明顯

13、高于成人正常腎近曲小管上皮細(xì)胞系HK-2，ACHN細(xì)胞株可以作為后續(xù)實驗的研究對象。
　　 第二部分靶向EZH2的siRNA有效序列的確定和干預(yù)載體的構(gòu)建
　　 目的:構(gòu)建針對目的基因EZH2的siRNA干預(yù)載體，并證實該載體轉(zhuǎn)染人腎癌ACHN細(xì)胞后是否對EZH2基因表達(dá)有抑制作用。
　　 方法:根據(jù)已有文獻(xiàn)報道選擇EZH2基因cDNA序列的461-481堿基為標(biāo)靶序列，設(shè)計目的shRNA所對應(yīng)的DNA模板鏈，退

14、火處理后克隆到含U6啟動子的空質(zhì)粒載體pGPU6/GFP/Neo，并構(gòu)建重組質(zhì)粒:pGPU6/GFP/Neo-EZH2 shRNA，經(jīng)酶切測序證實后，脂質(zhì)體介導(dǎo)將pGPU6/GFP/Neo-EZH2 shRNA轉(zhuǎn)染人腎癌ACHN細(xì)胞株。再以Western Blot方法檢測EZH2蛋白表達(dá)是否下降以證實該載體的作用。
　　 結(jié)果:將靶向EZH2基因RNAi的shRNA模板順利插入空質(zhì)粒載體，抽提并純化正確重組質(zhì)粒，根據(jù)所設(shè)立的三個

15、平行組:A組為空白組（ACHN細(xì)胞未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組）、B組為陰性對照組（ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo空質(zhì)粒組）和C組為干擾組(ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-EZH2 siRNA組)。以Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后三組ACHN細(xì)胞EZH2蛋白表達(dá)，根據(jù)所測得IOD比值計算(IODEZH2/IODGAPDH)，C組ACHN細(xì)胞EZH2蛋白表達(dá)明顯低于A、B兩組ACHN細(xì)胞(P＜0.01)，A、B兩組ACHN細(xì)

16、胞EZH2蛋白表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:1.成功構(gòu)建了pGPU6/GFP/Neo-EZH2 shRNA穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒;2.成功構(gòu)建了EZH2 siRNA穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞;3.EZH2 siRNA顯著下調(diào)了人腎癌細(xì)胞株ACHN細(xì)胞EZH2蛋白的表達(dá)。
　　 第三部分干擾EZH2基因?qū)θ四I癌細(xì)胞株ACHN增殖、凋亡及侵襲能力的影響
　　 目的:使用特異性的EZH2-shRNA干擾序列轉(zhuǎn)染人腎癌細(xì)胞株A

17、CHN，誘導(dǎo)EZH2基因沉默，觀察其對ACHN細(xì)胞增殖活性、凋亡及侵襲能力的影響。
　　 方法:使用第二部分中構(gòu)建的干預(yù)載體在最佳轉(zhuǎn)染條件下，用質(zhì)粒載體法轉(zhuǎn)染ACHN細(xì)胞株，根據(jù)所設(shè)立的三個平行組:A組為空白組（ACHN細(xì)胞未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組）、B組為陰性對照組（ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo空質(zhì)粒組）和C組為干擾組（ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-EZH2 siRNA組），應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)（Annex

18、in V/PI雙染法）及Transwell細(xì)胞侵襲實驗分別檢測三組中ACHN細(xì)胞株的細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力。
　　 結(jié)果:1.流式細(xì)胞儀檢測三組ACHN細(xì)胞凋亡指數(shù)AI值，根據(jù)所測得AI值(％)計算，C組ACHN細(xì)胞凋亡指數(shù)高于A、B兩組ACHN細(xì)胞凋亡指數(shù)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而A、B兩組ACHN細(xì)胞凋亡指數(shù)比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。2.分別于轉(zhuǎn)染24h、48h、72h及96h后，MTT比色法檢測三組ACH

19、N細(xì)胞的細(xì)胞增殖情況，除24h點外(P＞0.05)，其余時間點（48h、72h及96h）MTT檢測C組ACHN細(xì)胞570nm波長處OD值明顯低于A、B兩組ACHN細(xì)胞(P＜0.01)，且有統(tǒng)計學(xué)意義。3.Transwell實驗檢測三組ACHN細(xì)胞的侵襲能力，根據(jù)所測得下室中細(xì)胞數(shù)計算，C組ACHN細(xì)胞進(jìn)入下室內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量明顯少于A、B兩組ACHN細(xì)胞，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而A、B兩組ACHN細(xì)胞進(jìn)入下室內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量比較無統(tǒng)計

20、學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:1.EZH2 siRNA能夠明顯促進(jìn)ACHN細(xì)胞的凋亡;2.EZH2siRNA能夠明顯抑制ACHN細(xì)胞的增殖，并且這種抑制作用存在時間效應(yīng)關(guān)系;3.EZH2 siRNA能夠明顯抑制ACHN細(xì)胞的侵襲能力。
　　 第四部分EZH2-siRNA抑制人腎癌細(xì)胞株ACHN的分子生物學(xué)機制及與WNT/β-catenin信號通路系統(tǒng)關(guān)系的實驗研究
　　 目的:探討EZH2-siRNA抑制

21、人腎癌細(xì)胞株ACHN的分子生物學(xué)機制及與WNT/β-catenin信號通路系統(tǒng)的關(guān)系。
　　 方法:同第三部分設(shè)立A組:空白組（未轉(zhuǎn)染組）、B組:對照組（陰性對照載體組）和C組:RNA干擾組（干擾載體組）三組。應(yīng)用RT-PCR檢測三組ACHN細(xì)胞WNT3α、β-catenin、GSK-3βmRNA的變化，Western Blot檢測三組ACHN細(xì)胞WNT3α、β-catenin、GSK-3β蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1.

22、PCR檢測WNT3α條帶顯影定位于243bp處，β-catenin條帶顯影定位于194bp處，GSK-3β條帶顯影定位于153bp處，內(nèi)參GAPDH條帶顯影定位于450bp處。根據(jù)所測得WNT3α、β-catenin及GSK-3β的IOD值分別與各自同時進(jìn)行電泳的內(nèi)參GAPDH的IOD值計算IOD比值(IODWNT3α/IODGAPDH、IODβ-catenin/IODGAPDH、IODGSK-3β/IODGAPDH)，C組ACHN細(xì)胞

23、GSK-3β基因mRNA含量明顯高于A、B兩組ACHN細(xì)胞，表達(dá)差異具有顯著性(P＜0.01，P＜0.05);而WNT3α、β-catenin基因mRNA在C組ACHN細(xì)胞中的含量明顯低于A組ACHN細(xì)胞(P＜0.01，P＜0.01)和B組ACHN細(xì)胞(P＜0.01，P＜0.05)，表達(dá)差異具有顯著性。A、B兩組ACHN細(xì)胞WNT3α、β-catenin及GSK-3β三種基因mRNA含量差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。2.Wester

24、n blot檢測WNT3α條帶顯影定位于43KD處，WNT3α條帶顯影定位于92KD處，WNT3α條帶顯影定位于47KD處，內(nèi)參GAPDH條帶顯影定位于37KD處。根據(jù)所測得WNT3α、β-catenin及GSK-3β的IOD值分別與所測內(nèi)參GAPDH的IOD值計算IOD比值(IODWNT3α/IODGAPDH、 IODβ-catenin/IODGAPDH、IODGSK-3β/IODGAPDH),C組ACHN細(xì)胞GSK-3β蛋白表達(dá)明顯

25、高于A、B兩組ACHN細(xì)胞，表達(dá)差異具有顯著性(P＜0.01);而WNT3α、β-catenin蛋白在C組ACHN細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于A、B兩組ACHN細(xì)胞，表達(dá)差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:1，EZH2 siRNA能夠明顯抑制腎癌ACHN細(xì)胞中WNT3α、β-catenin基因mRNA及蛋白的表達(dá);2.EZH2 siRNA能夠明顯促進(jìn)腎癌ACHN細(xì)胞中GSK-3β基因mRNA及蛋白的表達(dá);3.EZH2 siRN