Treg-Th17在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的失衡表達(dá)及TNF-α拮抗劑對(duì)其影響研究.pdf

1、研究背景:
　　 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性侵蝕性周?chē)P(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病。發(fā)病率約為0.3～1％，其致殘率高，對(duì)病人的心理狀況和生命質(zhì)量帶來(lái)極大的負(fù)面影響。RA的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，迄今尚無(wú)根治療法。因此對(duì)RA進(jìn)行深入研究具現(xiàn)實(shí)意義。
　　 T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)一直被認(rèn)為在RA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，已經(jīng)明確CD4+T細(xì)胞參與了RA的發(fā)病機(jī)制。既往

2、認(rèn)為RA是Th1占優(yōu)勢(shì)的自身免疫病。RA患者滑膜中存在大量IFN-γ+Th1細(xì)胞的克隆，但是Th2型細(xì)胞因子IL-4含量很低或檢測(cè)不出，并發(fā)現(xiàn)大量IFN-γ+Th1細(xì)胞趨化到滑膜和滑液局部，滑液中CD4+IFN-γ+T細(xì)胞的百分率也高于外周血中，滑液中Th1/Th2比值也與患者活動(dòng)性高度相關(guān)。但越來(lái)越多的研究結(jié)果提示Th1細(xì)胞可能在RA發(fā)病中并非占有主導(dǎo)地位:IFN-γ基因敲除鼠仍可發(fā)生自身免疫病，甚至對(duì)自身免疫病更易感;阻斷IFN-γ

3、的治療并不能使膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen inducedarthritis，CIA)小鼠病情緩解，使曾經(jīng)被認(rèn)為在RA起重要作用的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ作用受到質(zhì)疑。這說(shuō)明除Th1外，還存在其他能誘導(dǎo)自身免疫的細(xì)胞亞群。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Tregs)和輔助性T細(xì)胞17(T help cell17，Th17)的發(fā)現(xiàn)，彌補(bǔ)了Th1/Th2介導(dǎo)效應(yīng)機(jī)制的不足，并成為免疫學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

4、>　　 Treg的最顯著功能特征是無(wú)反應(yīng)性和免疫抑制，它可以通過(guò)直接接觸抑制和分泌抗炎細(xì)胞因子，如IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)，限制抗感染效應(yīng)細(xì)胞的過(guò)度反應(yīng)，保護(hù)周?chē)＝M織免受損傷，在維護(hù)機(jī)體免疫平衡中發(fā)揮了重要作用。Foxp3（foxhead box protein3，叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子P3）是Treg細(xì)胞最特異的標(biāo)記物，控制Treg細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育，逆轉(zhuǎn)錄Foxp3可以轉(zhuǎn)化初始型CD4+CD25-T細(xì)胞，使其成為具有調(diào)節(jié)活

5、性的Treg細(xì)胞;相反剔除Foxp3基因的小鼠，可導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生致死炎癥疾病。研究顯示缺乏Treg細(xì)胞的小鼠早期即可出現(xiàn)嚴(yán)重的侵蝕性關(guān)節(jié)炎;早期RA患者的外周血中的CD4+CD25+Treg的數(shù)量比健康對(duì)照低?？赡苷且?yàn)檫@種細(xì)胞數(shù)量上的缺失，導(dǎo)致了免疫抑制功能的低下，給疾病的發(fā)生發(fā)展創(chuàng)造了條件。
　　 Th17細(xì)胞被認(rèn)為是一群重要的介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞，分泌高水平的IL-17具有強(qiáng)大促炎效應(yīng)，能夠通過(guò)多種途徑參與RA關(guān)節(jié)的慢性炎癥

6、和進(jìn)行性損害。RORγt(retinoid related orphan receptorγt,轉(zhuǎn)錄因子維甲酸受體相關(guān)孤兒受體γt)是Th17細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，研究證實(shí)，無(wú)論體外細(xì)胞因子誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞的分化，還是體內(nèi)Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)都需要RORγt的參與，是促進(jìn)Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。在CIA鼠模型中局部過(guò)表達(dá)IL-17能夠顯著上調(diào)RANKL及其受體的表達(dá)，因此能夠破壞滑液中RANKL/OPG的平衡而加

7、重骨破壞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步結(jié)果顯示，在關(guān)節(jié)炎早期階段應(yīng)用中和性抗IL-17抗體可以顯著減輕關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。另有研究采用抗IL-17的抗體或疫苗進(jìn)行阻斷治療，也達(dá)到緩解關(guān)節(jié)炎癥狀，減少關(guān)節(jié)損傷的療效。
　　 Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞之間存在復(fù)雜關(guān)系，二者在功能上相互拮抗，而在分化上相互抑制。TGF-β在機(jī)體Treg和Th17細(xì)胞分化平衡中起重要的調(diào)控作用。TGF-β通過(guò)誘導(dǎo)Foxp3的表達(dá)來(lái)促進(jìn)Treg的產(chǎn)生，從而抑制炎癥，防止自

8、身免疫反應(yīng);在感染環(huán)境下，內(nèi)源性TGF-β與炎癥介質(zhì)IL-6或IL-21通過(guò)抑制Foxp3的表達(dá)，使RORγt介導(dǎo)的Th17細(xì)胞分化途徑啟動(dòng)，而后隨著炎癥介質(zhì)如IL-6水平的降低，F(xiàn)oxp3的表達(dá)在抑制RORγt的功能同時(shí)促進(jìn)Treg的分化，維持Treg的功能，在清除感染后將效應(yīng)細(xì)胞的功能控制在合適狀態(tài)。TGF-β主要信號(hào)途徑相對(duì)簡(jiǎn)單。Smads蛋白家族在TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中扮演著重要角色，Smad2/3是TGF-β信號(hào)下傳的第一個(gè)

9、信號(hào)分子，屬受體激活型Smad(R-Smads)，在胞漿中與共同受體Smad(Co-Smad)協(xié)同參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Smad7則抑制Smads復(fù)合物的形成或抑制Smad2、Smad3磷酸化而阻止該信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。Smads蛋白對(duì)于TGF-β信號(hào)的動(dòng)態(tài)調(diào)控具重要意義。激活的Smad蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，并與其他核輔助因子共同調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。TGF-β/Smad通路能否作為疾病治療及發(fā)展藥物作用的靶點(diǎn)等問(wèn)題仍需進(jìn)一步探討。
　　

10、由于RA發(fā)病機(jī)制尚不明確，至今RA仍無(wú)根治的方法。相當(dāng)一部分RA患者采用常規(guī)的治療難以控制癥狀，而且缺乏證據(jù)證實(shí)這些治療可以抑制關(guān)節(jié)病變的進(jìn)展和改善疾病的預(yù)后。在過(guò)去的10年中，生物制劑已成為RA治療的主要突破點(diǎn)。TNF-α在RA患者外周血以及滑膜局部的高表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)顯示中和TNF-α后減少其他炎性因子的分泌，因此拮抗TNF-α作為RA的治療靶點(diǎn)。近年將TNF-α拮抗劑用于治療活動(dòng)性RA獲得成功，臨床試驗(yàn)表明抗TNF-α治療不但能夠改

11、善RA患者的癥狀和提高功能，而且可以有效控制病情的進(jìn)展，這是RA臨床治療的一個(gè)飛躍。盡管不同的臨床隨機(jī)試驗(yàn)已證實(shí)了各種TNF-α拮抗劑的有效性，但對(duì)其在 RA治療中的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究和探討。有體外研究認(rèn)為腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白（TNFR-Fc）對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療作用與誘導(dǎo)Treg細(xì)胞無(wú)關(guān)。但與此相矛盾的研究報(bào)道比比皆是，之前已有研究報(bào)道抗TNF-α治療不但使RA體內(nèi)Treg細(xì)胞免疫抑制功能恢復(fù)，還使其數(shù)量增加;對(duì)Crohn's

12、病的研究結(jié)果顯示抗TNF-α抗體不僅能直接中和TNF-α，還可能影響粘膜調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活化和擴(kuò)增，從而恢復(fù)粘膜內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。而對(duì)Th17細(xì)胞的影響，有研究推測(cè)TNF-α拮抗劑可能通過(guò)阻斷TNF-α使前炎性因子釋放減少或反向信號(hào)抑制細(xì)胞增殖或通過(guò)caspase3途經(jīng)促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡，從而下調(diào)分泌IL-17的Th17細(xì)胞合成，但二者在體內(nèi)相互作用的具體途徑有待于進(jìn)一步探索。而TNF-α拮抗劑對(duì)Treg/Th17細(xì)胞平衡的影響是否涉及TGF-

13、β/Smad通路，未見(jiàn)報(bào)道。
　　 在正常情況下Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的效應(yīng)處于一種平衡狀態(tài)，Treg/Th17平衡失調(diào)在組織炎癥和自身免疫性疾病等疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。然而，Treg/Th17失衡在RA和關(guān)節(jié)滑膜病變形成中的作用，以及Treg和Th17細(xì)胞分化所涉及TGF-β/Smad信號(hào)通路以及能否作為疾病治療及發(fā)展藥物作用的靶點(diǎn)等問(wèn)題尚有待于進(jìn)一步探討。為明確以上問(wèn)題，本研究建立大鼠CIA模型，觀察TNF-α拮

14、抗劑治療對(duì)關(guān)節(jié)滑膜病變和Treg/Th17平衡的影響;以臨床病人為研究對(duì)象，檢測(cè)RA患者Treg和Th17關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)情況，探討外周Treg/Th17失衡與RA病情活動(dòng)度的關(guān)系;通過(guò)TNF-α拮抗劑TNFR-Fc治療觀察對(duì)Treg/Th17平衡的影響，并首次從其對(duì)Treg和Th17細(xì)胞分化及TGF-β/Smad通路的影響來(lái)探討其機(jī)制;從而進(jìn)一步明確RA的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制及探索在此環(huán)節(jié)上進(jìn)行干預(yù)治療的意義，為臨床RA的干預(yù)

15、治療提供新思路。
　　 目的:
　　 1、觀察TNF-α拮抗劑治療對(duì)大鼠CIA模型關(guān)節(jié)滑膜中Treg/Th17平衡及相關(guān)細(xì)胞因子的影響。
　　 2、探討Treg與Th17細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子在RA中的失衡表達(dá)及與RA疾病活動(dòng)度的關(guān)聯(lián)。
　　 3、探討TNF-α拮抗劑TNFR-Fc治療對(duì)Treg/Th17分化及TGF-β/Smad通路的影響。
　　 方法:
　　 1、膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)

16、大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織Treg/Th17平衡及TNF-α拮抗劑對(duì)其影響研究
　　 30只Lewis大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型組、治療組。將牛源性Ⅱ型膠原和等體積不完全弗氏佐劑混合、乳化后，模型組和治療組大鼠于尾根部及背部多點(diǎn)皮下注射0.4ml/只，正常對(duì)照組大鼠皮下注射等量生理鹽水。7天后加強(qiáng)免疫，第13天治療組開(kāi)始采用10mg/kg TNFR-Fc腹腔注射，隔日一次;模型組則予等量生理鹽水腹腔注射，隔日一次。每周1次進(jìn)行關(guān)節(jié)炎的分

17、級(jí)評(píng)估，建模后35天處死大鼠，ELISA檢測(cè)血漿TNF-α，關(guān)節(jié)滑膜進(jìn)行甲苯胺藍(lán)、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠病理組織學(xué)變化，免疫熒光雙標(biāo)記法檢測(cè)各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜CD4+T細(xì)胞Treg/Th17關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3/RORγt的表達(dá)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織TGF-β1、IL-10、 IL-17蛋白的表達(dá)。
　　 2、RA患者外周血Treg/Th17的失衡表達(dá)及其臨床意義
　　 40例活動(dòng)期RA病人

18、（35例女性和5例男性）為2010年9月-2011年1月在廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院門(mén)診及住院病人，所有病人均符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)的RA分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)?；顒?dòng)期必須同時(shí)滿(mǎn)足下列條件:
　　 (1)4個(gè)或以上的關(guān)節(jié)腫脹;
　　 (2)6個(gè)或以上的關(guān)節(jié)觸痛;
　　 (3)符合下面兩條標(biāo)準(zhǔn)中任意1條:隨訪(fǎng)當(dāng)日晨僵持續(xù)時(shí)間≥45min，血沉（魏氏法）≥28mm/h，C反應(yīng)蛋白(CRP)＞10mg/L。臨床評(píng)估包括壓

19、痛和腫脹關(guān)節(jié)數(shù)，疼痛視覺(jué)模擬評(píng)分(VAS評(píng)分)，健康評(píng)估問(wèn)卷(HAQ)、DAS28評(píng)分和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)紅細(xì)胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）。
　　 健康對(duì)照組:健康體檢者40例，其中女性35例，男性5例，平均47.2歲（20-70歲）。年齡和性別比均衡性檢驗(yàn)顯示RA組和健康對(duì)照組間無(wú)差異。獲得研究對(duì)象知情同意后，抽取外周靜脈血。
　　 ELISA檢測(cè)RA患者和健康對(duì)照Treg/Th17相關(guān)細(xì)胞因子

20、(包括TGF-β1、IL-10、IL-17)表達(dá)水平。realtime-PCR檢測(cè)Treg/Th17關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3/RORγt mRNA表達(dá)水平。
　　 3、TNF-α拮抗劑對(duì)RA外周血Treg/Th17失衡的影響及其機(jī)制
　　 40例活動(dòng)期RA病人納入標(biāo)準(zhǔn)及臨床評(píng)估同第一部分。研究者對(duì)受試者進(jìn)行研究前，已經(jīng)對(duì)受試者進(jìn)行知情同意，并得到受試者的書(shū)面知情同意書(shū)。經(jīng)篩選檢查證實(shí)符合加入試驗(yàn)的條件后，受試者按2:1的比

21、例被隨機(jī)分配到治療組或?qū)φ战M，治療組為rhTNFR∶ Fc+MTX，對(duì)照組為安慰劑+MTX。受試者接受皮下注射rhTNFR∶ Fc或同等體積的安慰劑，25mg/次，2次/周，并在試驗(yàn)第0、6、12周按規(guī)定完成臨床病情的評(píng)估及相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室檢查等，由同一個(gè)醫(yī)師對(duì)病人進(jìn)行定期隨訪(fǎng)。研究結(jié)束時(shí)DAS28評(píng)分改善≥1.2或DAS28≤3.2定義為治療有效。治療組(28例)和對(duì)照組(12例)，年齡和性別比均衡性檢驗(yàn)顯示兩組間無(wú)差異（年齡:t=1.3

22、22，P＝0.194;性別:x2=2.449，P＝0.118）;兩組患者在基線(xiàn)時(shí)疾病狀況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具可比性（關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、VAS評(píng)分、HAQ評(píng)分、ESR、CRP、RF、DAS28評(píng)分，P均＞0.05）。
　　 ELISA檢測(cè)RA患者治療前后Treg/Th17相關(guān)細(xì)胞因子(包括TGF-β1、IL-10、IL-17)表達(dá)水平。realtime-PCR檢測(cè)RA患者治療前后Treg/Th17關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3/RO

23、Rγt和相關(guān)細(xì)胞因子（包括TGF-β1、IL-10、IL-17）以及TGF-β/Smad通路（包括Smad2、Smad3、Smad7）mRNA表達(dá)水平。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，計(jì)量資料組間比較，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析，方差不齊時(shí)采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn);組間多重比較采用SNK法或Dunn's多重

24、比較;治療前后比較根據(jù)數(shù)據(jù)分布類(lèi)型采用配對(duì)T檢驗(yàn)或符號(hào)秩和檢驗(yàn);不同指標(biāo)間的相關(guān)性用Spearman分析。
　　 結(jié)果:
　　 一、膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織Treg/Th17平衡及TNF-α拮抗劑對(duì)其影響
　　 1、模型的鑒定及評(píng)價(jià)
　　 造模后模型組大鼠平均第18天出現(xiàn)明顯關(guān)節(jié)炎癥狀，后足首先出現(xiàn)紅腫，然后前足紅腫，隨時(shí)間延長(zhǎng)，于21天左右達(dá)到高峰，嚴(yán)重者不能負(fù)重，關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙，提示大鼠CIA模

25、型建立。治療組大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎時(shí)間與模型組大致相似，高峰時(shí)間延遲至第28天，且關(guān)節(jié)炎程度較模型組顯著減輕(P＜0.001)。對(duì)照組關(guān)節(jié)無(wú)異常改變。
　　 病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，正常大鼠滑膜組織細(xì)胞排列規(guī)則，未見(jiàn)淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞的浸潤(rùn)及軟骨染色缺失;模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織呈重度增生，滑膜層變厚，排列紊亂，大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，軟骨重度缺失;治療組HE染色滑膜增生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較造模組輕，甲苯胺藍(lán)染色軟骨染色丟失較單純

26、造模組為輕。
　　 非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析ELISA結(jié)果，顯示三組間TNF-α濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=15.158，P=0.001），進(jìn)一步采用Dunn's多重比較顯示模型組顯著高于正常對(duì)照組（713.33±145.83 pg/ml vs24.86±3.12 pg/ml，P＜0.05），而治療組與正常對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(67.62±20.05 pg/ml vs24.86±3.12 pg/ml，P＞0.0

27、5)
　　 2、關(guān)節(jié)滑膜Foxp3、ROR-γt表達(dá)的比較
　　 結(jié)果顯示Treg和Th17細(xì)胞主要分布在滑膜襯里細(xì)胞層及血管周?chē)?方差分析結(jié)果顯示三組間CD4+Foxp3+Treg/CD4+細(xì)胞比例存在差異(F=6.096，P=0.012)，CD4+RORγt+Th17/CD4+細(xì)胞比例也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=40.791，P＜0.001)。模型組的CD4+Foxp3+Treg/CD4+細(xì)胞比例與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異(23

28、.12±4.93％ vs24.66±5.82％，P＞0.05)，治療組(33.07±5.14％)則較正常對(duì)照組和模型組增高(P＜0.05);模型組CD4+RORγt+Th17/CD4+細(xì)胞比例較正常對(duì)照組和治療組增高(模型組9.74±2.23％ vs正常對(duì)照組1.00±0.59％，治療組5.63±1.76％，P＜0.05)，而治療組也較正常對(duì)照組高(P＜0.05)。
　　 3、關(guān)節(jié)滑膜TGF-β1、IL-10、IL-17表達(dá)的比

29、較
　　 免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示，TGF-β1除了分布在滑膜襯里細(xì)胞層及血管周?chē)?，還可見(jiàn)于軟骨表面; IL-10、IL-17主要位于滑膜襯里細(xì)胞層及血管周?chē)?。方差分析顯示三組間的TGF-β1(F=19.841，P＜0.001)、IL-10(F=21.798，P＜0.001)、 IL-17(F=8.958，P=0.003)表達(dá)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。模型組TGF-β1蛋白的表達(dá)顯著高于正常組和治療組（P＜0.05），正常組和治療組之

30、間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.12);而IL-10蛋白的表達(dá)顯著低于正常組和治療組（P＜0.05），正常組和治療組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＝0.061);IL-17蛋白的表達(dá)顯著高于正常組和治療組（P＜0.05），正常組和治療組間無(wú)差異(P=0.149)。
　　 二、RA患者外周血Treg/Th17的失衡表達(dá)及其臨床意義
　　 1、RA與健康對(duì)照組之間關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3/RORγt和相關(guān)細(xì)胞因子(包括TGF-β1、IL-10、

31、IL-17)表達(dá)的比較
　　 RA組Foxp3 mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著減少（0.6542±0.3037 vs.1.4811±0.2958，t=-10.099，P=0.000），RORγt mRNA表達(dá)高于對(duì)照組(1.0278±0.3038 vs.0.4066±0.1519，U=12.000，P=0.000);RA組IL-10蛋白水平低于健康對(duì)照組(115.16±83.80 vs.204.86±66.01，t=-5.238，P＜

32、0.001)，而TGF-β1則顯著高于健康對(duì)照組(45386.31±16955.90 vs.6328.75±1670.48，t＝40.000，P＜0.001),IL-17蛋白水平也明顯高于對(duì)照組(88.33±90.12 vs.45.56±22.42，U=474.500，P=0.01)。
　　 2、RA患者關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3/RORγt的表達(dá)與臨床活動(dòng)度及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系
　　 RA患者外周血中Foxp3mRNA與關(guān)節(jié)

33、壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、患者疼痛模擬視覺(jué)評(píng)分(VAS)、健康評(píng)估問(wèn)卷(HAQ)、DAS28評(píng)分等臨床活動(dòng)指標(biāo)無(wú)明顯關(guān)系，而與ESR、CRP、RF等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)也無(wú)明顯相關(guān)性。RORγtmRNA與關(guān)節(jié)腫脹數(shù)呈正相關(guān)(r=0.495，P＜0.05)，與RF滴度正相關(guān)(r＝0.453，P＝0.014)，但與其他臨床活動(dòng)指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)也無(wú)明顯相關(guān)性。
　　 把RA組分為ESR＜28、28≤ESR＜100和ESR≥100三組，采用方差分析進(jìn)行

34、比較，結(jié)果顯示三組間的Foxp3 mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=2.360，P＝0.114)，ESR≥100的高炎癥程度患者的Foxp3 mRNA表達(dá)水平低于ESR＜28的病人但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.3623±0.2233 vs.0.7707±0.2848，P＞0.05);而三組間的RORγtmRNA表達(dá)具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=6.334，P＝0.006)，ESR≥100的病人其RORγtmRNA表達(dá)水平高于ESR＜28和28≤ESR＜100的

35、病人(1.5297±0.1652 vs.0.9844±0.2446，0.9608±0.2762, P＜0.05)。
　　 3、細(xì)胞因子與Foxp3/RORγt的表達(dá)及臨床活動(dòng)度、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系
　　 IL-10與Foxp3 mRNA表達(dá)正相關(guān)(r＝0.495，P=0.01)，而與關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、患者疼痛模擬視覺(jué)評(píng)分WAS)、健康評(píng)估問(wèn)卷(HAQ)、DAS2g評(píng)分等臨床病情活動(dòng)指標(biāo)無(wú)明顯關(guān)系;TGF-β1與Fox

36、p3mRNA、RORγt mRNA的表達(dá)、臨床病情活動(dòng)指標(biāo)均無(wú)相關(guān)性;IL-17與RORγ t mRNA表達(dá)正相關(guān)（r＝0.461，P=＝0.02），與關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)正相關(guān)(關(guān)節(jié)壓痛數(shù)r=0.341，P=0.042;關(guān)節(jié)腫脹數(shù)r=0.448，P=0.006)，與其他指標(biāo)無(wú)相關(guān)性。
　　 三、TNF-α拮抗劑對(duì)RA外周血Treg/Th17失衡的影響及其機(jī)制
　　 1、治療組與對(duì)照組治療前后臨床療效比較
　　

37、 rhTNFR∶ Fc治療12周后，關(guān)節(jié)壓痛數(shù)(Z=-2.443，P＝0.015)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)(Z＝-4.492，P＜0.001)、疼痛VAS評(píng)分(Z=-3.606，P＜0.001)和ESR(Z=-4.442，P＜0.001)、CRP(Z=-2.722，P＝0.006)、DAS28評(píng)分(Z=-4.441，P＜0.001)等療效指標(biāo)均較基線(xiàn)時(shí)水平明顯降低，而健康狀況問(wèn)卷（HAQ）(Z=-0.904，P＝0.366)和RF（Z=-0.148

38、，P=0.882）則與基線(xiàn)水平無(wú)明顯差異;對(duì)照組治療12周后，關(guān)節(jié)壓痛數(shù)（Z=-0.307，P=0.759）、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)（t=0.099，P=0.923）、HAQ(Z=-0.866,P＝0.387)和ESR(t=1.494,P＝0.163)、CRP(Z=-0.356,P＝0.722)、RF(Z=-0.784，P=0.433)、DAS28評(píng)分(t=1.018，P＝0.330)等療效指標(biāo)均較基線(xiàn)時(shí)水平無(wú)明顯差異，僅疼痛VAS評(píng)分較基線(xiàn)時(shí)水平

39、降低(t=2.446，P=0.032)。
　　 2、治療組與對(duì)照組治療前后Foxp3/RORγt和相關(guān)細(xì)胞因子(包括TGF-β1、IL-10、IL-17)表達(dá)的比較
　　 在12周抗TNF治療結(jié)束后，治療組Foxp3和IL-10 mRNA表達(dá)較治療前升高（Foxp3治療后1.1244±0.3244vs.治療前0.7374±0.2777，t=-4.552，P＜0.001;IL-10治療后1.0579±0.2573 vs.治

40、療前0.5261±0.1594，t=-7.508，P＜0.001），RORγt、TGF-β1、IL-17 mRNA表達(dá)較治療前降低(RORγ t治療后0.8230±0.2692vs.治療前1.0777±0.2830，t=-3.230，P＝0.001;TGF-β1治療后0.6651±0.1902 vs.治療前0.8853±0.1845，Z=-3.806，P＜0.001;IL-17治療后0.8753±0.2093 vs.治療前1.0238±

41、0.1880,t=3.546,P=0.002）。
　　 治療組IL-10蛋白水平較治療前顯著增高（治療后219.12±57.15 vs.治療前123.90±87.24，Z=-3.829，P＜0.001），TGF-β1和IL-17蛋白水平較治療前顯著降低(TGF-β1治療后26607.84±9984.16 vs.治療前45643.54±18999.01，t＝4.699，P＜0.001;IL-17治療后57.07±33.04 vs.

42、治療前73.59±46.35，Z=-2.291，P＝0.022)。
　　 對(duì)照組Foxp3mRNA表達(dá)較治療前顯著增高(治療后0.9730±0.4744 vs.治療前0.3925±0.2348,Z=-2.197,P＝0.028)，而RORγt、IL-10、TGF-β1、IL-17 mRNA表達(dá)治療前后無(wú)明顯改變（RORγt治療后0.8592±0.3929 vs.治療前0.8709±0.3355，t＝0.093，P=0.929;I

43、L-10治療后0.5763±0.1587 vs.治療前0.5481±0.1313，t=-0.668，P＝0.529; TGF-β1治療后0.5147±0.2586 vs.治療前0.8300±0.2955，t=1.403，P＝0.210;IL-17治療后1.0469±0.2457 vs.治療前1.0995±0.1460, t=0.660, P＝0.534)。
　　 對(duì)照組TGF-β1蛋白水平較治療前下降（治療后25042.03±1

44、0949.11 vs.治療前44850.40±12365.26，t=7.538，P＜0.001），IL-10、IL-17蛋白水平治療前后無(wú)明顯改變(IL-10治療后158.48±52.96 vs.治療前96.96±76.44，Z=-1.646，P＝0.100)、(IL-17治療后111.95±104.28 vs.治療前121.83±146.60，Z=-1.027，P=0.284)。
　　 3、治療組中治療有效和無(wú)效者Foxp3/

45、RORγt和相關(guān)細(xì)胞因子(包括TGF-β1、IL-10、IL-17)表達(dá)的比較
　　 結(jié)果顯示無(wú)論是治療有效還是無(wú)效患者，治療后Foxp3 mRNA表達(dá)均較治療前顯著增高（有效患者治療后1.1109±0.3713 vs.治療前0.6684±0.3404，t＝-3.492，P=0.005;無(wú)效患者治療后1.1405±0.2766 vs.治療前0.8203±0.1559，t＝-2.850，P＝0.019)，而RORγtmRNA表達(dá)則

46、均較治療前降低（有效患者治療后0.8097±0.3425 vs.治療前1.0744±0.3613，Z=-2.118，P=0.034;無(wú)效患者治療后0.8390±0.1588 vs.治療前1.0817±0.1652，t=3.341，P=0.009)。
　　 治療有效患者治療后TGF-β1的mRNA(0.3438±0.0921 vs.0.7094±0.1881，t=5.050，P＜0.001)和蛋白水平(27986.77±10627

47、.45 vs.49391.23±23002.53，t=3.195，P=0.007)均顯著下降，IL-10 mRNA(1.0410±0.3065 vs0.5182±0.1745，Z＝-2.934，P=0.003）和蛋白水平(217.67±52.81 vs.138.43±111.29，t=-3.080，P=0.009)均顯著高于治療前，IL-17mRNA較治療前降低(0.8033±0.1836 vs.1.0160±0.1982，t＝4.12

48、9，P＝0.002)，蛋白水平也較治療前稍降低，但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(48.87±28.99 vs.65.66±34.69，Z=-1.960，P=0.050);
　　 無(wú)效者治療后TGF-β1的mRNA(0.3276±0.0924 vs.0.6163±0.1900，t=3.441，P＝0.007)和蛋白水平(24852.83±9293.26 vs.40873.77±11565.87，t＝4.335，P＝0.001)均顯著下降，IL-

49、10水平(mRNA:1.0765±0.2051 vs.0.5348±0.1500，t=-6.680,P＜0.001;蛋白:220.97±64.87 vs.105.41±38.66,t=-5.899,P＜0.001)升高，但I(xiàn)L-17水平與治療前無(wú)明顯改變（mRNA:0.9545±0.2158 vs.1.0324±0.1864,Z=-1.274,P＝0.203;蛋白:67.52±36.26 vs.83.67±58.23,Z=-1.246,

50、P＝0.213)。
　　 進(jìn)一步分析所有RA病人治療后DAS28評(píng)分與Treg、 Th17細(xì)胞以及細(xì)胞因子的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)治療后DAS28評(píng)分與基線(xiàn)時(shí)的Foxp3 mRNA表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=-0.380，P=0.042)，與基線(xiàn)時(shí)的RORγt mRNA表達(dá)(r=0.407，P＝0.028)、12周的IL-17蛋白水平(r＝0.362，P＝0.030)呈正相關(guān);除此以外，治療后DAS28評(píng)分與其他細(xì)胞因子無(wú)相關(guān)性。當(dāng)我們進(jìn)一步分析不同

51、組中治療后DAS28評(píng)分與Treg、Th17細(xì)胞相關(guān)性時(shí)，僅發(fā)現(xiàn)TNF-α拮抗劑治療組DAS28評(píng)分與基線(xiàn)時(shí)的RORγtmRNA表達(dá)存在正相關(guān)(r=0.430，P=0.046)。
　　 4、治療組與對(duì)照組治療前后TGF-β/Smad通路(包括Smad2、Smad3、Smad7)mRNA表達(dá)的比較
　　 抗TNF治療12周后的RA患者Smad2的表達(dá)較基線(xiàn)水平降低(0.3361±0.0903 vs.0.2936±0.097

52、6，Z=-2.728，P＝0.006)，Smad3較基線(xiàn)水平升高(0.3132±0.1216 vs.0.3841±0.1288,t=-4.124,P=0.001)，而Smad7 mRNA的表達(dá)則稍降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.1218±0.2157 vs.1.0387±0.2268，t=1.566，P＝0.133);予MTX治療的對(duì)照組RA患者Smad2（0.3773±0.0471 vs.0.3406±0.0582,t=1.808, P＝0

53、.121）、Smad3(0.2149±0.1172 vs.0.3201±0.1138,t＝-1.643,P=0.151)、Smad7(1.1072±0.1538 vs.1.0194±0.1681,t=1.271,P=0.251)mRNA的表達(dá)治療前后無(wú)明顯差異。
　　 5、治療組中治療有效和無(wú)效者TGF-β/Smad通路(包括Smad2、Smad3、Smad7) mRNA表達(dá)的比較
　　 治療有效的病人(DAS28評(píng)分改

54、善≥1.2或DAS28≤3.2)，Smad2的表達(dá)較基線(xiàn)水平降低(0.2786±0.0870 vs.0.3438±0.0921，t=3.660，P=0.004)，Smad3較基線(xiàn)水平升高（0.4206±0.1204 vs.0.3280±0.1270，t=-3.660，P＝0.004），而Smad7則無(wú)明顯改變（1.008±0.2076 vs.1.153±0.2051，t=1.790，P=0.104）;無(wú)效的患者Smad2、Smad3、S

55、mad7 mRNA表達(dá)治療前后均無(wú)明顯差異(Smad20.3276±0.0924 vs.0.3102±0.1102,t=0.944, P=0.370;Smad30.2968±0.1198 vs.0.3440±0.1318, t=-2.154, P=0.060;Smad71.0874±0.2326 vs.1.0721±0.2530,t=0.236，P＝0.819)。
　　 結(jié)論:
　　 1、RA外周及關(guān)節(jié)滑膜存在Treg/

56、Th17分化及功能失衡，疾病活動(dòng)度越高的患者Treg/Th17分化失衡越顯著，提示Treg/Th17失衡可能在RA的發(fā)病中起重要作用;
　　 2、RA患者外周血Treg/Th17分化失衡及功能失調(diào)在抗TNF治療(TNFR∶Fc)治療下得以恢復(fù)，而且這種恢復(fù)并非MTX的作用。
　　 3、基線(xiàn)時(shí)Th17的RORγtmRNA表達(dá)水平可能是預(yù)測(cè)TNF-α拮抗劑治療效果的有用指標(biāo)，而IL-17的蛋白水平可能更與病情活動(dòng)度相關(guān)。