siRNA抑制ZNF139對人胃癌裸鼠原位移植瘤細胞凋亡影響及機制研究.pdf

1、目的:胃癌是一種常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的健康。近年大量研究表明，鋅指蛋白Krüppel家族中的許多成員可以通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達，來介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和演進。ZNF139就屬于Krüppel家族成員。本課題組前期研究表明:ZNF139在大多數(shù)胃癌中高表達，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。而ZNF139基因的表達與胃癌細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2的表達是否有關(guān)尚無報道，有待于通過實驗進一步證實。本實驗利用重組質(zhì)粒si

2、RNA-ZNF139沉默人胃癌細胞SGC-7901裸鼠原位移植瘤中ZNF139基因的表達，以觀察研究其對人胃癌裸鼠原位移植瘤細胞凋亡水平的影響，探討ZNF139與胃癌細胞凋亡的關(guān)系及機制。
　　 方法:
　　 1.重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139及陰性對照質(zhì)粒control-siRNA由天根生化科技有限公司設(shè)計合成，應(yīng)用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取重組質(zhì)粒。抽提完畢后，所提取的質(zhì)粒經(jīng)紫外分光光度儀檢測濃度和純度。利用RT-

3、PCR方法檢測重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139的沉默效率。
　　 2.以人胃癌細胞株SGC-7901反復(fù)接種傳代于BALB/C-(nu/nu)裸小鼠皮下形成的皮下移植瘤組織塊為材料，將傳代6次的組織塊接種在裸小鼠胃壁漿膜層下，觀察裸鼠的生存狀態(tài)及移植瘤的生長情況。建立人胃癌細胞株SGC-7901裸鼠原位移植瘤動物模型。
　　 3.待腫瘤直徑約5mm時，將其隨機分為3組，空白對照組、陰性對照組和實驗組，每組5只。1天、3天

4、、5天、7天、9天，利用微量注射器分別將生理鹽水50μl，control-siRNA20μg，重組質(zhì)粒siRNA-ZNF13920μg注射入對應(yīng)組的裸鼠原位移植瘤內(nèi)。每天觀察原位移植瘤的生長情況。
　　 4.在每次對瘤內(nèi)進行注射前和處死裸鼠剝?nèi)≡灰浦擦龊鬁y量移植瘤的最長徑(A)及最短徑(B)，根據(jù)公式:腫瘤體積(mm3)=1/2×A×B2，計算腫瘤的近似體積，并制作腫瘤的生長曲線。
　　 5.對裸鼠干預(yù)5次后，于第11

5、天頸椎脫臼處死全部裸鼠，完整剝離瘤體，稱取瘤重，以計算腫瘤抑制率，腫瘤抑制率=（對照組瘤重-實驗組瘤重）/對照組瘤重×100％。
　　 6.處死裸鼠，完整剝離瘤體后，取少量新鮮瘤體標本，制作單細胞懸液，利用MTT法測定三組裸鼠胃癌細胞的存活率。
　　 7.通過流式細胞儀檢測三組裸鼠胃癌細胞的凋亡率。
　　 8.利用RT-PCR方法測定三組裸鼠胃癌細胞中ZNF139、Bax、Bcl-2基因在mRNA水平的表達并進行

6、比較。
　　 結(jié)果:
　　 1.ZNF139基因沉默效率的檢測
　　 空白對照組ZNF139mRNA表達量(0.3586±0.0361)明顯高于實驗組(0.1237±0.0131)，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.00）。陰性對照組ZNF139mRNA表達量(0.3601±0.0296)明顯高于實驗組(0.1237±0.0131)，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。沉默效率為65.7％。
　　 2.人胃癌細

7、胞株SGC-7901裸鼠原位移植瘤模型的建立成功建立人胃癌細胞株SGC-7901裸鼠原位移植瘤模型，成瘤率100％(15/15)。
　　 3.重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139對人胃癌裸鼠原位移植瘤體的影響
　　 3.1移植瘤的生長情況
　　 空白對照組裸鼠腫瘤終體積(361.21±15.09)mm3明顯大于實驗組裸鼠腫瘤終體積(153.14±5.78)mm3，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。陰性對照組裸鼠腫瘤

8、終體積(354.09±9.79)mm3明顯大于實驗組裸鼠腫瘤終體積(153.14±5.78)mm3，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)?？瞻讓φ战M與陰性對照組之間差異則無統(tǒng)計學意義(P=0.32)。與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組腫瘤體積生長速度明顯減慢(Fig.5)，而陰性對照組腫瘤體積的生長速率略小于空白對照組。
　　 3.2重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139的抑瘤作用
　　 空白對照組裸鼠腫瘤的重量(2.41±0

9、.13)g明顯大于實驗組裸鼠腫瘤的重量(1.11±0.06)g，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。陰性對照組裸鼠腫瘤的重量(2.30±0.10)g明顯大于實驗組裸鼠腫瘤的重量(1.11±0.06)g，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)?？瞻讓φ战M與陰性對照組之間差異則無統(tǒng)計學意義(P=0.11)。與空白對照組相比，實驗組的抑瘤率為53.94％，而陰性對照組的抑瘤率僅為4.56％。
　　 4.重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139對人

10、胃癌裸鼠原位移植腫瘤細胞存活率的影響
　　 空白對照組裸鼠胃癌細胞的吸光度值(0.5014±0.0487)明顯高于實驗組裸鼠胃癌細胞的吸光度值(0.2768±0.0048)，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。陰性對照組裸鼠胃癌細胞的吸光度值(0.4926±0.0715)明顯高于實驗組裸鼠胃癌細胞的吸光度值(0.2768±0.0048)，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.01）?？瞻讓φ战M與陰性對照組之間差異則無統(tǒng)計學意義(P=0.9

11、7)。
　　 5.重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139對人胃癌裸鼠原位移植腫瘤細胞凋亡的影響
　　 空白對照組裸鼠胃癌細胞的凋亡率(18.3800±4.6855)％明顯低于實驗組裸鼠胃癌細胞的凋亡率(33.3900±2.2393)％，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00）。陰性對照組裸鼠胃癌細胞的凋亡率(16.9160±2.6913)％明顯低于實驗組裸鼠胃癌細胞的凋亡率(33.3900±2.2393)％，差異具有統(tǒng)計學意義(P=

12、0.00）?？瞻讓φ战M與陰性對照組之間差異則無統(tǒng)計學意義(P=0.51)。
　　 6.ZNF139、Bax、Bcl-2/mRNA在三組裸鼠胃癌組織中的表達情況
　　 6.1ZNF139mRNA的表達
　　 ZNF139在實驗組裸鼠胃癌組織中的表達水平(0.1237±0.0131)明顯低于空白對照組(0.3586±0.0361)，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。ZNF139在實驗組裸鼠胃癌組織中的表達水平(0.

13、1237±0.0131)明顯低于陰性對照組(0.3601±0.0296)，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)?？瞻讓φ战M與陰性對照組之間差異則無統(tǒng)計學意義(P=0.93）。
　　 6.2BaxmRNA的表達
　　 Bax在實驗組裸鼠胃癌組織中的表達水平(0.4981±0.0704)明顯高于空白對照組(0.2036±0.0531)，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00）。Bax在實驗組裸鼠胃癌組織中的表達水平(0.4981±0

14、.0704)明顯高于陰性對照組(0.1981±0.0547)，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.00）?？瞻讓φ战M與陰性對照組之間差異則無統(tǒng)計學意義(P=0.89）。
　　 6.3Bcl-2mRNA的表達
　　 Bcl-2在實驗組裸鼠胃癌組織中的表達水平(0.0357±0.0039)明顯低于空白對照組(0.1379±0.0366)，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。Bcl-2在實驗組裸鼠胃癌組織中的表達水平(0.0357±0

15、.0039)明顯低于陰性對照組(0.1437±0.0379)，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)?？瞻讓φ战M與陰性對照組之間差異則無統(tǒng)計學意義(P=0.77)。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功建立人胃癌組織塊裸鼠原位移植瘤模型。
　　 2.應(yīng)用重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139抑制ZNF139基因可以顯著的抑制裸鼠原位移植瘤的生長，使其生長速度減慢，體積變小。
　　 3.重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139可以降