siRNA干擾FPR后U87細(xì)胞裸鼠腦原位移植瘤生物學(xué)行為及血管生成特點(diǎn)改變及機(jī)制.pdf

1、近年來(lái)，趨化因子及其受體在惡性腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲以及轉(zhuǎn)移中的作用越來(lái)越受重視。研究顯示，一些表達(dá)在正常細(xì)胞的與特定生理或病理過(guò)程相關(guān)的趨化因子受體也可能表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，而且在腫瘤演進(jìn)中發(fā)揮作用。腫瘤演進(jìn)是復(fù)雜的過(guò)程，涉及瘤細(xì)胞和宿主多方面、多階段的相互作用。其中，瘤細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)、釋放蛋白水解酶增多、產(chǎn)生過(guò)多的促血管生成因子等重要改變，以及在瘤細(xì)胞與宿主相互作用過(guò)程中其調(diào)節(jié)紊亂是重要的研究?jī)?nèi)容，有關(guān)的受體也可能作為新的治療措施的

2、靶點(diǎn)。 FPR是吞噬細(xì)胞表達(dá)的一種G蛋白偶聯(lián)受體，受內(nèi)源性(如線(xiàn)粒體蛋白來(lái)源)或外源性(如細(xì)菌蛋白來(lái)源)配體N-甲?；膄MLF激活后使細(xì)胞趨化能力增強(qiáng)，并釋放炎癥介質(zhì)，從而發(fā)揮免疫功能。最近研究發(fā)現(xiàn)，此受體也表達(dá)于惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞，而且，體外激活可使瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，VEGF產(chǎn)生增多。惡性膠質(zhì)瘤的特點(diǎn)是侵襲能力強(qiáng)，血管內(nèi)皮增生活躍，容易出現(xiàn)壞死，而壞死物中的fMLF正好是FPR的激動(dòng)劑，所以二者的存在和相互作用可能是惡性膠質(zhì)

3、瘤細(xì)胞增殖、侵襲和促血管生成的重要機(jī)制之一。 為研究惡性膠質(zhì)瘤中FPR受體表達(dá)和激活在促進(jìn)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲與促血管生成中的作用和機(jī)制，本研究將已經(jīng)成功地利用siRNA干擾了FPR的GBM細(xì)胞株U87應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中，從以下三個(gè)方面進(jìn)行了研究：(1)檢測(cè)siRNA干擾FPR后的U87細(xì)胞(FPR-siRNA U87)的VEGF、MMP-2和-9蛋白表達(dá)以及相應(yīng)配體fMLF激活后表達(dá)的改變：(2)觀察siRNA干擾FPR后的U87細(xì)胞裸

4、鼠腦原位移植瘤的生長(zhǎng)、分化、侵襲和血管生成相關(guān)的形態(tài)學(xué)改變；(3)進(jìn)一步檢測(cè)siRNA干擾FPR后的U87細(xì)胞裸鼠腦原位移植瘤組織中VEGF、MMP-2和-9蛋白表達(dá)改變，同時(shí)檢測(cè)膠質(zhì)瘤分化標(biāo)志物vimentin。主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.用轉(zhuǎn)染了針對(duì)FPR構(gòu)建的siRNA的U87細(xì)胞(FPR-siRNA U87)，以野生型U87細(xì)胞和Mock轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Mock)為對(duì)照進(jìn)行體外培養(yǎng)，并用其已知最佳濃度(10.nmol/L)的特異

5、性配體fMLF刺激，采用ELIsA方法檢測(cè)培養(yǎng)6小時(shí)后細(xì)胞上清液中VEGF、MMP-2和-9蛋白含量，發(fā)現(xiàn)FPR-siRNA U87細(xì)胞VEGF表達(dá)顯著低于對(duì)照細(xì)胞，且表達(dá)不象對(duì)照細(xì)胞一樣受fMLF刺激影響。FPR-siRNA U87細(xì)胞MMP-9表達(dá)低于對(duì)照細(xì)胞，但與對(duì)照細(xì)胞一樣，fMLF刺激后分泌改變不明顯。而FPR-siRNA U87細(xì)胞的MMP-2表達(dá)卻比未受fMLF刺激的對(duì)照細(xì)胞高，但Mock細(xì)胞受刺激后表達(dá)明顯升高。這些結(jié)果

6、說(shuō)明VEGF表達(dá)與受體激活關(guān)系最為密切，而MMP-2和-9表達(dá)與受體表達(dá)有某種關(guān)系，但可能還受其它因素影響和調(diào)節(jié)，需要結(jié)合體內(nèi)研究說(shuō)明。 2.用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)FPR-siRNA U87細(xì)胞中VEGF蛋白和細(xì)胞膜上FPR受體表達(dá)，發(fā)現(xiàn)二者染色強(qiáng)度都比對(duì)照細(xì)胞者低。用RT-PCR檢測(cè)上述條件下培養(yǎng)細(xì)胞的VEGF、MMP-2和-9的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FPR-siRNA U87細(xì)胞VEGF的mRNA表達(dá)出現(xiàn)與上清液中蛋白表達(dá)相似的

7、改變趨勢(shì)，而MMP-2和-9的mRNA表達(dá)在6小時(shí)未顯示表達(dá)差異。這些結(jié)果同樣說(shuō)明VEGF表達(dá)與受體表達(dá)和激活關(guān)系密切，而MMP-2和-9表達(dá)可能還受其它因素影響和調(diào)節(jié)，包括轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。 3.以野生型U87細(xì)胞和Mock細(xì)胞為對(duì)照，將FPR-siRNA U87細(xì)胞原位接種到裸鼠腦內(nèi)，比較觀察不同時(shí)間點(diǎn)(1w、2w、4w、5w及6w)移植瘤大小，光鏡和電鏡下觀察其生長(zhǎng)、分化、侵襲和促血管生成相關(guān)的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)FPR沉默后移植瘤

8、生長(zhǎng)明顯較緩慢，沒(méi)有對(duì)照細(xì)胞移植瘤在5w至6w出現(xiàn)的加速生長(zhǎng)；細(xì)胞分化較高、核分裂像少、侵襲能力較弱，移植瘤中血管數(shù)明顯較少，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)較接近正常。這些結(jié)果說(shuō)明該受體體內(nèi)表達(dá)和激活與惡性膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)、分化、侵襲和促血管生成能力有關(guān)。 4.用Western blotting方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FPR-siRNA U87細(xì)胞裸鼠腦原位移植瘤組織中VEGF、MMP-2和-9蛋白表達(dá)下降，用免疫組化方法檢測(cè)瘤組織中上述蛋白，發(fā)現(xiàn)VEGF和MMP

9、-9蛋白表達(dá)明顯降低。另外，vimentin染色明顯減弱。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明該受體表達(dá)和激活可通過(guò)介導(dǎo)或影響VEGF、MMP-2和-9表達(dá)，促進(jìn)移植瘤侵襲和血管生成，還說(shuō)明受體表達(dá)與裸鼠腦原位移植瘤細(xì)胞分化有關(guān)。 本研究說(shuō)明，用siRNA沉默U87細(xì)胞的FPR可使細(xì)胞分化提高、增殖減慢，并通過(guò)下調(diào)MMP-2及-9和VEGF而削弱其侵襲和促血管生成能力，反過(guò)來(lái)說(shuō)明該受體在惡性膠質(zhì)瘤中的生長(zhǎng)、侵襲和促血管生成中的作用，因而可作為抗膠