紫肉甘薯花色素苷生物合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子克隆與功能分析.pdf

1、紫肉甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)是一種薯皮為紫黑色、肉質(zhì)為紫紅色的甘薯類型,屬于旋花科甘薯屬蔓生習(xí)性草本植物。紫肉甘薯塊根中紫皮和紫肉均可食用,食味甘而甜,纖維少,口感較好,富含淀粉、維生素、氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分,其提取物具有抗壞血酸、抗癌、抗高血糖、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗突變、抗菌作用等多種藥理作用。這些藥理作用大部分都與紫肉甘薯中富含的花色素苷有關(guān)。紫肉甘薯中花色素苷含量為20-180 mg/100 g鮮重。紫

2、肉甘薯塊根中浸提的花色素苷是優(yōu)質(zhì)天然花色素苷,可以替代人工合成色素,在食品、醫(yī)藥、化妝品方面有著較大應(yīng)用潛力。
　　 花色素苷是水溶性黃酮類色素中最重要的一類,是花色素與各種單糖通過(guò)糖苷鍵形成的糖基化衍生物總稱,屬于植物次生代謝產(chǎn)物.花色素苷經(jīng)苯丙氨酸合成途徑和類黃酮生物合成途徑合成,生物合成途徑需一系列酶催化和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控.花色素苷合成途徑調(diào)控主要是受R2R3-MYB類、bHLH類和WD40類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,且一般是由MYB、

3、bHLH和WD40蛋白形成蛋白復(fù)合體,直接調(diào)控結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。為研究紫肉甘薯中花色素苷生物合成途徑中的調(diào)控機(jī)理,為花色素苷次生代謝工程提供新靶點(diǎn),本研究采用RACE技術(shù)首次從渝紫263中克隆出來(lái)自MYB、bHLH和WD40家族與花色素苷合成相關(guān)的5個(gè)基因,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。此外,還采用HPLC和比色法對(duì)渝紫263各組織中花色素苷含量進(jìn)行分析。
　　 MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族相關(guān)基因的調(diào)節(jié)活性是自然界中植物著色模式多變的主要原因,R

4、2R3MYB家族與類黃酮和花色素苷生物合成途徑調(diào)控緊密相關(guān)。本研究采用RACE技術(shù),克隆渝紫263中R2R3MYB家族的一個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA,并命名為IbMYB1(GenBank登錄號(hào)為:JQ337861)。生物信息學(xué)分析表明,IbMYB1基因的cDNA全長(zhǎng)1198 bp(不含ployA),包含長(zhǎng)度為750 bp的編碼框,長(zhǎng)為184 bp的5'-端非翻譯區(qū)和長(zhǎng)為164 bp的3'-端非翻譯區(qū)。預(yù)測(cè)結(jié)果表明IbMYB1基因編碼249個(gè)氨

5、基酸的蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)分子量大小為28.6kDa,等電點(diǎn)(pI)為8.57,為堿性蛋白,包含36.55%的α-螺旋、8.03%的延伸鏈、4.42%的β-轉(zhuǎn)角和51.0%不規(guī)則卷曲。氨基酸序列的多重比對(duì)表明,IbMYB1與植物中已鑒定的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子序列保守區(qū)主要存在于N-端R2R3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其C-端相在各物種間相似性很低。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)也顯示IbMYB1三級(jí)結(jié)構(gòu)只在R2R3區(qū)域建模成功,與雞MYB蛋白的R2R3結(jié)構(gòu)域(1

6、A5J)類似,R2和R3結(jié)構(gòu)域分別由2個(gè)和3個(gè)α-螺旋組成。將IbMYB1與其它植物中MYB類轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建分析表明,IbMYB1與大多數(shù)已鑒定調(diào)控花色索苷生物合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子聚為一支。采用熒光定量PCR對(duì)IbMYB1進(jìn)行在渝紫263組織表達(dá)譜分析結(jié)果表明在塊根中表達(dá)量最高,其次是直徑0.5 cm塊根(Φ0.5塊根)、外周皮、莖節(jié)、莖間、葉柄、須根、葉和幼莖尖.
　　 bHLH類轉(zhuǎn)錄因子能夠識(shí)別花色素合成途徑中關(guān)鍵酶

7、基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-BOX(CANNTG)。其與DNA結(jié)合時(shí),通常需要兩個(gè)不同bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成二聚體才能完成。本研究通過(guò)RACE技術(shù),從渝紫263中成功克隆bHLH家族中的兩個(gè)基因,分別命名為IbbHLH1和IbbHLH2,登錄號(hào)為分別:JQ337862和JQ337863。生物信息學(xué)分析表明,IbbHLH1基因cDNA全長(zhǎng)為2467 bp,長(zhǎng)度為1890 bp的編碼框,5'-UTR長(zhǎng)為427 bp和長(zhǎng)為150 bp的3'-UTR。其

8、編碼629個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),預(yù)測(cè)該蛋白分子量大小為69.5kDa,等電點(diǎn)為5.10,為酸性蛋白,包含α-螺旋34.82%、延伸鏈9.38%、β-轉(zhuǎn)角2.86%和不規(guī)則卷曲52.94%。IbbHLH2基因cDNA序列全長(zhǎng)2280 bp,包含了編碼框長(zhǎng)度為2025 bp,5'-UTR長(zhǎng)為108 bp,3'-UTR長(zhǎng)147bp。IbbHLH2基因編碼674個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白分子量大小為75.1 kDa,等電點(diǎn)為5.07,為酸

9、性蛋白,包含α-螺旋45.40%、延伸鏈10.83%、β-轉(zhuǎn)角4.60%和不規(guī)則卷曲39.17%。氨基酸序列多重比對(duì)表明,雖IbbHLH1和IbbHLH2分別聚為不同支,但它們?cè)诳拷麼-端的一部分和HLH結(jié)構(gòu)域部分相似性較高。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)兩個(gè)蛋白只有在HLH結(jié)構(gòu)域部位建模成功,預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)中IbbHLH1和IbbHLH2均由兩個(gè)α-螺旋和中間連接的不規(guī)則卷曲組成,與DNA結(jié)合的活性部位位于蛋白的N-端。采用熒光定量PCR對(duì)IbbHLH1和I

10、bbHLH2在渝紫263組織表達(dá)譜分析結(jié)果表明,IbbHLH1在須根中表達(dá)量最高,其次是葉柄、幼莖尖和莖間、塊根、Φ0.5塊根、莖節(jié)、葉和外周皮;而IbbHLH2在Φ0.5塊根中表達(dá)量很高,在塊根和外周皮中表達(dá)量也相對(duì)較高,其在其它的組織中都表達(dá)量很低。
　　 WD40類轉(zhuǎn)錄因子在多種植物中被鑒定為激活花色素苷轉(zhuǎn)錄復(fù)合體必不可少的轉(zhuǎn)錄因子。本研究通過(guò)RACE技術(shù),從渝紫263中成功克隆了WD40家族中的兩個(gè)WD40基因,分別命名

11、為IbWDR1和IbWDR2,基因登錄號(hào)分別為:JQ340206和JQ337864。生物信息學(xué)分析表明,IbWDR1的cDNA序列全長(zhǎng)1239 bp,包含了長(zhǎng)度為1032 bp的編碼框,長(zhǎng)為64bp的5'-UTR和長(zhǎng)為143 bp的3'-UTR。IbWDR1編碼343個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),該蛋白分子量為38.09kDa,等電點(diǎn)為4.97,為酸性蛋白,包含α-螺旋10.20%、延伸鏈34.99%、β-轉(zhuǎn)角3.50%和不規(guī)則卷曲51.31%。I

12、bWDR2的cDNA序列全長(zhǎng)1299 bp,包含了長(zhǎng)度為1041 bp的編碼框,長(zhǎng)為136 bp的5'-UTR和長(zhǎng)為121 bp的3'-UTR,編碼346個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),蛋白分子量為39.09 kDa,等電點(diǎn)(pI)為4.71,為酸性蛋白,包含α-螺旋10.40%、延伸鏈32.37%、β-轉(zhuǎn)角4.91%和不規(guī)則卷曲52.31%。多重比對(duì)表明,IbWDR1和IbWDR2在各物種相對(duì)比較保守,特別是蛋白質(zhì)中間偏后的一部分。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

13、顯示,IbWDR1和IbWDR2均具由7個(gè)區(qū)域圍成一個(gè)環(huán)狀的結(jié)構(gòu),并且每個(gè)區(qū)域都是有4個(gè)β-延伸鏈組成。渝紫263組織表達(dá)譜分析結(jié)果表明,IbWDR1和IbWDR2在各組織中表達(dá)量均相對(duì)較高,IbWDR1在葉柄、幼莖尖、Φ0.5塊根和外周皮中表達(dá)量比莖間、須根、塊根、莖節(jié)和葉相對(duì)高一些;IbWDR2的表達(dá)量在Φ0.5塊根、塊根和幼莖尖比其它組織要高些,其它組織依次是莖節(jié)、須根、葉柄、外周皮、葉和莖間。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用10 mL

14、1%甲酸化甲醇作為提取液,提取渝紫263各組織的花色素苷,分別用HPLC和紫外分光光度計(jì)對(duì)花色素苷進(jìn)行含量檢測(cè),構(gòu)建渝紫263的組織含量譜。通過(guò)含量分析表明,外周皮中的花色素苷含量最高,其次是塊根和基部莖,在葉和葉柄中花色素苷的含量都較低。
　　 對(duì)IbMYB1、IbbHLH1、IbbHLH2、IbWDR1和IbWDR2基因的克隆和功能分析有助于在分子水平上更好地了解這三類轉(zhuǎn)錄因子在花色素苷的生物合成中的作用,并為今后調(diào)控花色素