嬰幼兒關(guān)節(jié)軟骨細胞的體外培養(yǎng)和表型研究及逆向誘導(dǎo)分化初探.pdf

1、一、嬰幼兒關(guān)節(jié)軟骨細胞體外培養(yǎng)及其鑒定
　　目的:探索體外培養(yǎng)嬰幼兒關(guān)節(jié)軟骨細胞的方法，并對其細胞表型進行鑒定，為下一步逆向誘導(dǎo)分化提供細胞。
　　方法:取多指患兒指間關(guān)節(jié)的軟骨，經(jīng)過機械剪切、胰酶、膠原酶的消化獲得細胞后，用1640培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)。
　　倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)、生長情況，繪制關(guān)節(jié)軟骨細胞生長曲線；透射電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)； Alcian blue染色、蕃紅花“O”-亮綠染色檢驗細胞產(chǎn)生的蛋白

2、聚糖；阿利新蘭法檢測不同代次細胞蛋白聚糖含量；免疫組織化學(xué)染色檢測細胞分泌的II型膠原。
　　結(jié)果:嬰幼兒關(guān)節(jié)軟骨細胞貼壁生長。原代細胞生長緩慢，細胞10~15天長滿六孔培養(yǎng)板的一孔，進行傳代；第1代、2代、3代等細胞生長旺盛，3~5天長滿40ml培養(yǎng)瓶的一瓶；細胞在第12代、13代出現(xiàn)凋亡表現(xiàn)。
　　關(guān)節(jié)軟骨細胞的生長曲線呈倒“S”型，透射電子顯微鏡觀察到細胞具有軟骨細胞共性。Alcian blue染色陽性，蕃紅花“O”-

3、亮綠染色陽性；第1、2、3代關(guān)節(jié)軟骨細胞蛋白聚糖含量逐漸增高，第5、6代后細胞蛋白聚糖含量逐漸減低；免疫組織化學(xué)染色證實細胞分泌II型膠原。
　　結(jié)論:在體外成功建立了嬰幼兒關(guān)節(jié)軟骨細胞的培養(yǎng)方法，經(jīng)多種鑒定證實所培養(yǎng)出的細胞是關(guān)節(jié)軟骨細胞。
　　二、嬰幼兒關(guān)節(jié)軟骨細胞采用iPS技術(shù)逆向誘導(dǎo)分化的初步研究
　　目的:嘗試采用iPS技術(shù)誘導(dǎo)嬰幼兒關(guān)節(jié)軟骨細胞逆向分化為多能分化狀態(tài)。
　　方法:先培養(yǎng)胎鼠肌細胞并用絲