慢病毒介導(dǎo)的Caveolin-1小干擾RNA對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞株生長(zhǎng)作用的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言:
　　 下咽鱗狀細(xì)胞癌是耳鼻咽喉頭頸外科最常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)生位置隱蔽、浸潤(rùn)性極強(qiáng)、易粘膜下擴(kuò)散、原發(fā)病變呈多中心生長(zhǎng)的特點(diǎn)。因早期無明顯的癥狀、缺乏特異性體征和可靠的診斷措施，所以，多數(shù)患者在臨床確診并接受治療時(shí)，已屬于晚期，病變常累及喉腔、頸段食道和舌根等器官;同時(shí)，由于喉咽部淋巴管豐富，極易發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和包膜外擴(kuò)散，并侵犯周圍組織器官，如頸動(dòng)脈等重要的血管，所以，下咽鱗癌是頭頸部預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。由

2、于下咽癌生長(zhǎng)部位的特殊性，手術(shù)治療后，可能導(dǎo)致語(yǔ)言、呼吸及吞咽器官的功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量;而放療和化療又存在治療不徹底、并發(fā)癥多、患者痛苦較大等問題。因此，盡快在分子生物學(xué)的基礎(chǔ)上提出新的診斷方法和簡(jiǎn)便有效、毒副作用小的治療手段就成為亟須解決的課題。
　　 生物膜是細(xì)胞生命活動(dòng)的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤的演進(jìn)密切相關(guān)。上個(gè)世紀(jì)50年代，Yamada用電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)并命名了細(xì)胞質(zhì)膜微囊-Caveolae;1

3、972年，Singer和Nicolson提出“液相雙層脂質(zhì)鑲嵌模型”;20世紀(jì)90年代研究發(fā)現(xiàn):細(xì)胞膜的雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)是不均一的，結(jié)構(gòu)蛋白Caveolin與某些富含膽固醇和鞘脂的微區(qū)域的結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)，這些區(qū)域被稱為脂筏，無結(jié)構(gòu)蛋白時(shí)呈平板狀，脂筏與Caveolin結(jié)合后形成的燒瓶狀膜結(jié)構(gòu)即Caveolae。
　　 Caveolin-1(CAV1)是Caveolae的標(biāo)志性蛋白，為分子量約22kd的膜內(nèi)蛋白質(zhì)，其基因位于7q31

4、.1，是形成燒瓶狀結(jié)構(gòu)Caveolae的必需成分。目前，CAV1與腫瘤形成之間的關(guān)系已成為研究的熱點(diǎn)。
　　 研究證實(shí):在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，如乳腺癌、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、肉瘤，CAV1表達(dá)下降，為抑癌基因;但在某些腫瘤，如甲狀腺濾泡狀癌中沒有CAV1的表達(dá);而在前列腺癌、胰腺導(dǎo)管腺癌及食道鱗狀細(xì)胞癌中其表達(dá)水平上調(diào)，提示:在這些癌的形成過程中，CAV1是作為腫瘤促進(jìn)因子。因此，CAV1在腫瘤中的作用可能與組織相關(guān)。
　　

5、 在本課題中，我們成功構(gòu)建了CAV1-小干擾RNA-慢病毒載體，通過感染下咽癌FaDu細(xì)胞株，進(jìn)而檢測(cè)CAV1對(duì)該細(xì)胞株體外生長(zhǎng)的作用;并成功構(gòu)建下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞株移植瘤動(dòng)物模型，通過定期瘤體注射CAV1-小干擾RNA-慢病毒載體，以及后期對(duì)腫瘤組織的檢測(cè)來研究CAV1對(duì)FaDu細(xì)胞株體內(nèi)生長(zhǎng)的作用。
　　 目的:
　　 構(gòu)建人CAV1-小干擾RNA-慢病毒載體(CAV1-RNAi-lentivirus)并轉(zhuǎn)

6、染下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞株，篩選獲得穩(wěn)定干擾CAV1表達(dá)的FaDu細(xì)胞。進(jìn)而探討CAV1-RNAi-lentivirus對(duì)人下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞株體內(nèi)和體外生長(zhǎng)的影響。
　　 方法:
　　 1.構(gòu)建人CAV1-RNA干擾慢病毒載體。設(shè)計(jì)針對(duì)CAV1的shRNA序列，AgeⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行載體質(zhì)粒雙酶切，應(yīng)用基因重組技術(shù)插入pGCSL-GFP慢病毒表達(dá)載體中，RT-PCR和DNA測(cè)序鑒定重組克隆。重組病毒質(zhì)粒及

7、其3種輔助包裝原件載體質(zhì)粒通過LipofectamineTM2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，將其濃縮后在293T細(xì)胞中測(cè)定病毒滴度，并進(jìn)行大量包裝和備用細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
　　 2.CAV1-RNAi-lentivirus對(duì)FaDu細(xì)胞體外生長(zhǎng)的作用。應(yīng)用CAV1-RNAi-lentivirus轉(zhuǎn)染FaDu細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)設(shè)立pGCSL-GFP-空載體對(duì)照組(GFP-lentivirus)和空白對(duì)照組。確定G41

8、8的最佳篩選濃度，于轉(zhuǎn)染24h后，加入最佳篩選濃度的G418篩選穩(wěn)定干擾CAV1表達(dá)的細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)成肉眼可見的克隆后，使用浸有胰酶的無菌濾紙片消化挑取克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)。熒光倒置顯微鏡下觀察并計(jì)算CAV1-RNAi-lentivirus的轉(zhuǎn)染效率。采用RT-PCR、Western-blot方法檢測(cè)細(xì)胞中CAV1的mRNA和蛋白水平的敲除效率。應(yīng)用原位末端標(biāo)記法(TdT-mediateddUTPnickendlabeling，TUNEL)

9、檢測(cè)轉(zhuǎn)染CAV1-RNAi-lentivirus后FaDu細(xì)胞的體外凋亡情況。
　　 3.CAV1-RNAi-lentivirus對(duì)FaDu細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的作用。構(gòu)建BALB/c-nude裸鼠下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞株移植瘤模型，待腫瘤長(zhǎng)至一定時(shí)間和體積時(shí)，將所有動(dòng)物隨機(jī)分組。實(shí)驗(yàn)設(shè)立GFP-lentivirus陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。給藥方法采用瘤周多點(diǎn)注射。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物每周定期瘤周注射CAV1-RNAi-lentivirus(

10、1×107TU，0.1ml)，陰性對(duì)照組動(dòng)物注射GFP-lentivirus(1×107TU，0.1ml)，空白對(duì)照組注射同劑量的PBS，并每隔4d測(cè)量各組所有動(dòng)物的腫瘤最長(zhǎng)徑與最短徑，計(jì)算腫瘤體積變化和抑制率。自注射時(shí)間起32d后，采用脫臼法處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并取出移植瘤，測(cè)量標(biāo)本體積并稱重。以RT-PCR、免疫組化等方法檢測(cè)三組腫瘤組織中目的基因CAV1的mRNA和蛋白表達(dá)變化情況，從而對(duì)CAV1-小干擾RNA-慢病毒載體在FaDu細(xì)胞株

11、體內(nèi)生長(zhǎng)的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1.RT-PCR和DNA測(cè)序鑒定重組克隆結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)采用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建CAV1-小干擾RNA-慢病毒載體，命名為CAV1-RNAi-lentivirus，測(cè)定滴度為1×108U/ml。
　　 2.將CAV1-小干擾RNA-慢病毒載體轉(zhuǎn)染下咽癌FaDu細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，30天后獲得穩(wěn)定干擾CAV1表達(dá)的細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率＞90％。運(yùn)用

12、RT-PCR檢測(cè)方法證實(shí)，與空白對(duì)照組(1.297±0.068)和陰性對(duì)照組(1.183±0.093)相比，RNA干擾組細(xì)胞的CAV1的mRNA表達(dá)明顯降低(0.47±0.050，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western-blot檢測(cè)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組(0.973±0.117)和陰性對(duì)照組(0.83±0.091)相比，CAV1-RNAi-Lentivirus轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的CAV1蛋白表達(dá)水平（0.43±0.098，P＜0.05

13、）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TUNEL檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，與空白對(duì)照組(AI=5.55±0.47％)和陰性對(duì)照組(AI=7.52±1.90％)相比，CAV1-RNAi-Lentivirus轉(zhuǎn)染組(AI=22.39±2.61％，P＜0.05)細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.成功構(gòu)建BALB/c-nude裸鼠下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞株移植瘤模型。定期注射CAV1-RNAi-Lentivirus組的裸鼠移植瘤平均重

14、量和體積(1.24±0.42g，1.40±0.49cm3)，均低于陰性對(duì)照組裸鼠移植瘤(1.79±0.42g，1.97±0.45cm3)和空白對(duì)照組移植瘤(1.88±0.54g，2.10±0.55cm3，P＜0.05)。抑瘤率分別為30.8％和34.0％。
　　 對(duì)各組移植瘤進(jìn)行的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，與空白對(duì)照組(1.348±0.031)和陰性對(duì)照組(1.175±0.055)相比，CAV1-RNAi-Lentivirus注

15、射組腫瘤組織的CAV1mRNA(0.671±0.070，P＜0.05)表達(dá)水平降低，條帶亮度明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化染色結(jié)果顯示，雖然治療組移植瘤CAV1蛋白表達(dá)下降，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 本研究結(jié)果表明，重組CAV1-RNAi-lentivirus在體外轉(zhuǎn)染下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞株后，G418篩選30天后可以獲得穩(wěn)定干擾CAV1表達(dá)的細(xì)胞，RT-PCR和Wester

16、n-blot檢測(cè)方法驗(yàn)證了基因的敲除效率。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)過程中，下調(diào)CAV1基因的表達(dá)，F(xiàn)aDu細(xì)胞的凋亡比對(duì)照組明顯增加。實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建BALB/c-nude裸鼠下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞株移植瘤模型，待腫瘤長(zhǎng)至一定體積后，應(yīng)用CAV1-RNAi-lentivirus定期瘤內(nèi)多點(diǎn)注射，可以減緩腫瘤組織的生長(zhǎng)，即FaDu細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)增殖受到抑制。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CAV1在下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞株的生長(zhǎng)過程中可能