軸突導(dǎo)向因子-1對胎盤血管形成作用的研究.pdf

1、胎盤是母體與胎兒之間進(jìn)行氣體交換、營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)、排除代謝產(chǎn)物的器官。在妊娠過程中，胎盤血管承擔(dān)著胎兒全部的血供需求，對胎兒宮內(nèi)發(fā)育起著極其重要的作用。胎盤血管形成障礙可導(dǎo)致妊娠結(jié)局不良，其中包括大多數(shù)的圍生期胎兒的并發(fā)癥，如胎兒生長受限（FGR）、胎兒窘迫、早產(chǎn)，以及遠(yuǎn)期的胎兒并發(fā)癥如小腦發(fā)育不良，而且還與母體的妊娠高血壓疾病有關(guān)。因此研究胎盤血管形成無疑具有重要的意義。研究表明，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、纖維母細(xì)胞生長因子（FGF

2、）、血管肽素（ANG）等均參與胎盤血管形成。除了這些傳統(tǒng)的因子，一些新的血管形成調(diào)節(jié)因子正在被逐步發(fā)掘。
　　 Netrin-1是一類高度保守的層粘連蛋白相關(guān)分子，屬于netrins家族，其作為經(jīng)典的神經(jīng)導(dǎo)向因子而聞名。由于神經(jīng)和血管的生長方式十分相似，它們均是層次有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并沿著相同的路線，相互依賴。因此，這使人們對netrin-1在血管中的作用產(chǎn)生濃厚興趣。研究發(fā)現(xiàn)，netrin-1具有與VEGF相同的促血管生成作用，

3、是一種正向血管生成調(diào)節(jié)因子。但也有不少研究顯示了不同的結(jié)果，認(rèn)為在血管生長和形成的過程中，netrin-1是作為一種排斥信號(hào)存在的。因此，netrin-1在血管形成中的作用尚不明確。而且，在母體中胎盤是唯一無神經(jīng)分布但富含血管的組織，netrin-1是否參與胎盤血管的形成和發(fā)育呢？
　　 本研究通過細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)研究netrin-1在胎盤血管發(fā)育中的作用，為探索胎盤血管發(fā)育尋找新的研究途徑，并為增加胎盤血供提供新的理論依據(jù)

4、。
　　 第一部分軸突導(dǎo)向因子-1在血管生成模型中的作用研究
　　 目的：由于神經(jīng)和血管的生長發(fā)育過程有很大相似性。Netrin-1作為經(jīng)典的神經(jīng)導(dǎo)向因子，其在血管生成中具有的作用無疑令人關(guān)注。盡管有實(shí)驗(yàn)證實(shí)了netrin-1促血管生成的作用，但也有不少研究顯示了相反的結(jié)果。Netrin-1在血管生成中的確切作用尚不明確，還存在不少爭論。而且這些研究大部分都集中在體外培養(yǎng)模型上。體外培養(yǎng)模型因?yàn)椴荒苣M體內(nèi)復(fù)雜血管生成過

5、程，有其一定的局限性。因此，本研究擬利用離體和在體血管生成模型，模擬的條件更接近體內(nèi)環(huán)境，也更為接近機(jī)體的生理狀態(tài)，進(jìn)一步闡明netrin-1與血管生成之間的聯(lián)系。
　　 方法：
　　 1．離體大鼠動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)：取SD大鼠，無菌條件下切取胸主動(dòng)脈，立即放入DMEM液中清洗，在解剖顯微鏡觀察下，脈管外纖維和脂肪組織。切取1mm長的動(dòng)脈環(huán)，用DMEM液沖洗數(shù)遍。在孔板內(nèi)加入Matrigel做鋪墊。再加入正在凝結(jié)的Matrige

6、l，立即放入動(dòng)脈環(huán)，37℃內(nèi)放置30 min，后分別加入含10、50、100 ng/mL netrin-1的無血清培養(yǎng)液，37 ℃、5％ CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)微血管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量。
　　 2．活體內(nèi)Matrigel plug實(shí)驗(yàn)：取雄性C57/BL6小鼠，分為對照組和netrin-1組，分別沿腹膜正中線注射50 U/mL肝素和0.5ml的Matrigel（對照組含PBS，netrin-1組含50ng/mL ne

7、trin-1）。7天后處死小鼠，取出Matrigel plug，照相。分析Matrigel plug內(nèi)的血紅素值水平。4％多聚甲醛固定、包埋、切片，采用免疫熒光染色法檢測CD34的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1．離體大鼠動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入10 ng/mL，50 ng/mL和100 ng/mL netrin-1各組血管生成數(shù)量發(fā)分別為186.29±35.77，291.50±52.47，267.12±44.93均多于對

8、照組56.25±10.79，差異有顯著性。其中50 ng/mL netrin-1促血管生成效應(yīng)最為顯著。
　　 2．進(jìn)一步用50 ng/mL netrin-1做活體內(nèi)Matrigel plug實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，包含有netrin-1的Matrigel plug轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，陰性對照組未見明顯變色。血紅素值分析結(jié)果顯示，含有netrin-1的Matrigel plug的血紅素值為53.4±7.3，大于對照組（5.8±0.9），差異有極

9、顯著性。用血管內(nèi)皮標(biāo)記物CD34抗體行Matrigel plug切片免疫熒光染色，含有netrin-1的Matrigel plug內(nèi)可見血管樣結(jié)構(gòu)，對照組中未見。
　　 結(jié)論：Netrin-1作為一種神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子，其在離體和在體血管生成模型中均具有促血管生成效應(yīng)，是一種有效的血管生成因子。
　　 第二部分胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與鑒定
　　 目的：由于胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成胎盤屏障的主要成分之一，不僅具有調(diào)

10、節(jié)血管通透性、進(jìn)行物質(zhì)交換和代謝、免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)的作用，而且還是胎盤血管形成發(fā)育以及相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。大量研究資料表明，微血管內(nèi)皮細(xì)胞不同于大血管內(nèi)皮細(xì)胞，其在許多病理生理過程中起著關(guān)鍵性的作用。采用不同器官或組織來源的微血管內(nèi)皮細(xì)胞研究相關(guān)發(fā)病機(jī)制已經(jīng)成為非常有價(jià)值的技術(shù)方法。因此，為了探討netrin-1在胎盤血管形成中的作用，本研究擬采用酶消化和不連續(xù)Percoll密度梯度離心法分離人胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　

11、方法：
　　 1．分離人胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞：無菌留取自愿人工流產(chǎn)的健康孕婦絨毛組織，用預(yù)冷的含抗生素生理鹽水沖洗兩次。留取三級(jí)絨毛或是絨毛末端。將組織剪碎經(jīng)過Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型Dispase酶、Ⅰ型DNA酶和胰酶消化后，將所得消化液經(jīng)篩網(wǎng)過濾，收集濾液，離心，收集沉淀，用DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，重懸液貼管壁緩慢加入25％、30％、35％不連續(xù)Percoll梯度中，離心后收集距離液面1.5-2.0 cm的白色絮狀層，加入DMEM培養(yǎng)

12、液重懸接種于培養(yǎng)瓶。
　　 2．免疫熒光染色鑒定細(xì)胞：傳代后，制備細(xì)胞爬片，用vWF行免疫熒光染色。爬片用預(yù)冷的4％多聚甲醛固定。加正常山羊血清封閉30 min，傾去。加vWF多克隆抗體，4℃孵育過夜。用FITC綠色熒光標(biāo)記IgG二抗?jié)窈袃?nèi)孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察。
　　 3．RT-PCR鑒定細(xì)胞：根據(jù)報(bào)道，TLX1和TLX2等同源基因在胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞和大血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)有明顯差異，這種差異可作為區(qū)分兩者的方

13、法之一。本研究利用RT-PCR檢測TLX1、TLX2 mRNA在所分離細(xì)胞中的表達(dá)情況?？俁NA的提取按照Total RNA Extraction Miniprep system說明進(jìn)行，用RevertAid First StrandcDNASynthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
　　 結(jié)果：
　　 1．倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)的胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和大小差異很大，可呈紡錘形、三角形或不規(guī)則形

14、等多種形態(tài)。傳代細(xì)胞初種時(shí)懸浮在培養(yǎng)液中，為明亮的圓球形，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后細(xì)胞即可貼壁，7天后細(xì)胞能增殖鋪滿培養(yǎng)瓶底，表現(xiàn)為明顯“鋪路石”征。
　　 2．vWF免疫熒光檢測，結(jié)果顯示，細(xì)胞胞漿發(fā)綠色熒光，呈陽性表達(dá)。證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 3．TLX1 mRNA在所分離的細(xì)胞中表達(dá)量（0.612±0.023）與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（0.074±0.011）比較差異十分顯著；TLX2 mRNA在所分離的細(xì)胞中表達(dá)

15、量（0.579±0.01）與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（0.105±0.017）比較差異顯著，證實(shí)分離的細(xì)胞為胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞，而不是大血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 結(jié)論：成功分離并培養(yǎng)人胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 第三部分軸突導(dǎo)向因子-1 對胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響
　　 目的：Netrin-1作為第一個(gè)被鑒定出來的可溶性神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子，其在神經(jīng)導(dǎo)向和遷移形成中發(fā)揮重要作用。近年來，netrin-1在血管生長發(fā)育過程中的

16、功能備受關(guān)注。胎盤血管床作為母體和胎兒進(jìn)行物質(zhì)交換的主要途徑，承擔(dān)著妊娠過程中胚胎和胎兒全部的血供需求。胎盤血管的良好發(fā)育對胚胎和胎兒宮內(nèi)發(fā)育起著極為重要的作用。前期的研究證實(shí)，netrin-1在胎盤中表達(dá)并與胎盤血管床密度呈正相關(guān)。為了進(jìn)一步闡明netrin-1與胎盤血管的關(guān)系，本研究擬通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察其對胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，以期了解netrin-1在胎盤血管形成發(fā)育過程中的作用。
　　 方法：
　　 1．M

17、TT：將細(xì)胞分為4組，分別為空白對照組、10 ng/mL netrin-1組，50 ng/mL netrin-1組和100 ng/mL netrin-1組，接種于48孔板內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)24 h后每孔加入5mg/mLMTT，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，終止培養(yǎng)，每孔加入DMSO溶液150 μl，充分振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀檢測570 nm處各孔吸光值。
　　 2．遷移試驗(yàn)：于Transwell小室上層加入含n

18、etrin-1濃度分別為10、50和100 ng/mL的無血清培養(yǎng)液，同時(shí)加入0.1 ml細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為3×105/mL，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，取出Transwell小室，用棉簽擦去上室面的細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，顯微鏡下隨機(jī)5個(gè)視野計(jì)數(shù)下室面細(xì)胞。
　　 3．管腔形成試驗(yàn)：將細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液重懸，接種于包被有Matrigel（300 μl）的24孔培養(yǎng)板中，分別加入10、50和100 ng/mL net

19、rin-1，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后倒置相差顯微鏡下觀察，以形成的管腔數(shù)量表示不同netrin-1濃度下細(xì)胞形成管腔的能力。
　　 4．凋亡檢測：用10、50、100 ng /mL netrin-1處理細(xì)胞48 h后，將培養(yǎng)液倒入離心管，貼壁細(xì)胞用0．25％胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，與培養(yǎng)液中收集的懸浮細(xì)胞一起離心，棄上清，沉淀的細(xì)胞以PBS洗兩遍，最后留少許液體重懸，振蕩條件下逐漸滴加入預(yù)冷的70％ 乙醇

20、5ml，4℃保存待測。測定前用PBS洗去乙醇，加入PI染液，室溫下避光染色30 min后，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡，計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)果：
　　 1．MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示netrin-1濃度為10、50和100 ng/mL時(shí)吸光值分別為0.324±0.02、0.503±0.019和0.447±0.032，與對照組（0.203±0.012）比較，均有差異顯著性。
　　 2．Netrin-1濃度為10、5

21、0和100 ng/mL時(shí)，遷移細(xì)胞數(shù)分別為15.6±0.5、20.8±0.9和19.6±0.2，均明顯多于對照組9.4±0.4（p<0.05或p<0.01）。
　　 3．在10、50和100 ng/mL濃度的netrin-1作用下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形成管腔的數(shù)量分別為13±1、14±2和19±2，與對照組（8±1）比較，p均<0.05。
　　 4．流式細(xì)胞儀檢測和分析結(jié)果顯示，隨著netrin-1濃度增加，細(xì)胞凋亡率呈遞減趨勢