CX32和CX43在癲癇幼鼠海馬區(qū)的表達(dá)及甘珀酸的干預(yù)作用.pdf

1、癲癇(epilepsy)是一種復(fù)雜的臨床綜合征，是由多種病因引起的，以腦部神經(jīng)元過度放電所致的突然的、反復(fù)的、短暫的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病。它是嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病之一，給社會(huì)、家庭和個(gè)人帶來了難以估量的沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因其較高的發(fā)病率和嚴(yán)重的危害性，成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患中最受關(guān)注的一組疾病。近年來，癲癇的研究在許多方面已取得了很大進(jìn)展，但就其發(fā)病機(jī)制仍不是十分清楚。
　　 縫隙連接(gapjun

2、ction GJ)為細(xì)胞膜上的一種特殊結(jié)構(gòu)，是相鄰細(xì)胞間唯一能直接進(jìn)行能量、物質(zhì)和信息交換的特殊通道。信息離子，小分子物質(zhì)可經(jīng)過該通道進(jìn)行細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)?？p隙連接在神經(jīng)元電活動(dòng)的維持、神經(jīng)元快速同步化、神經(jīng)元的發(fā)育中發(fā)揮著十分重要的作用，同時(shí)還參與傳遞第二信使及整合膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)縫隙連接在癲癇形成和發(fā)展過程中發(fā)揮著十分重要的作用。連接蛋白32(connexin32 CX32)、連接蛋白43(connexin43CX43)

3、是組成中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間縫隙連接的主要蛋白。CX32、CX43與癲癇的關(guān)系也備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。
　　 甘珀酸為非選擇性縫隙連接阻斷劑，能通過衍生物直接與縫隙連接結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化，從而導(dǎo)致通道關(guān)閉。
　　 目的
　　 本研究在建立鋰.匹羅卡品癲癇幼鼠模型的基礎(chǔ)上，探討CX32和CX43與癲癇的關(guān)系及其在癲癇形成中的作用，縫隙連接阻斷劑甘珀酸可能具有潛在的抗癲癇作用。
　　 材料與方

4、法
　　 1.分組：21日齡健康SD大鼠120只，雌雄不限，體重(65-70)g，隨機(jī)分成為對(duì)照組(n=40)、模型組(n=40)、干預(yù)組(n=40)。
　　 2.行為學(xué)觀察：各組大鼠在藥物處理后，立即進(jìn)行觀察，每天至少5個(gè)小時(shí)；凡連續(xù)出現(xiàn)3次Ⅳ級(jí)以上發(fā)作，為完全點(diǎn)燃。癇性發(fā)作強(qiáng)度參考Racine6級(jí)(0-V)評(píng)定法。
　　 3.標(biāo)本采集與制備：每組分別于24小時(shí)、3天、7天、30天經(jīng)各取10只經(jīng)乙醚麻醉后，剪開

5、胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，以20ml注射器連接5號(hào)頭皮針經(jīng)左心室灌注9g/L鹽水和40g/L多聚甲醛，直至右心耳流出澄清液體、肝臟發(fā)白、軀干變硬為止。斷頭取腦，做冠狀切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色及連接蛋白CX32和CX43免疫組化檢測(cè)。
　　 4.指標(biāo)測(cè)定
　　 1)由于鋰-匹羅卡品癲癇動(dòng)物模型特點(diǎn)，行為學(xué)觀察分三個(gè)階段進(jìn)行：
　　 急性期：重型發(fā)作的次數(shù)，潛伏期長(zhǎng)度；
　　 靜止期：靜止期的長(zhǎng)度

6、；
　　 自發(fā)性反復(fù)發(fā)作期(spontaneous recurrent seizures SRSs)：自發(fā)性反復(fù)發(fā)作的次數(shù)；
　　 2)HE染色：常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理改變。
　　 3)胞核染成棕黃色者判為CX32、CX43陽性表達(dá)產(chǎn)物，然后用彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量切片海馬CA1區(qū)CX32、CX43吸光度值(OD)，每張切片取5個(gè)視野測(cè)量取其平均值，同時(shí)測(cè)量同一張切片胼胝體的OD值以作為背景O

7、D值，用矯正吸光度值COD(實(shí)測(cè)值-背景值)進(jìn)行比較和分析，以避免染色過程中非特異性染色所造成的誤差。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，成組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.行為學(xué)評(píng)估結(jié)果：模型組大鼠急性期重型發(fā)作(RacineⅣ-Ⅴ級(jí))次數(shù)較干預(yù)組明顯增高(P<0.05)，且

8、其潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；對(duì)照組無癇樣發(fā)作。
　　 2.海馬區(qū)HE染色：與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬區(qū)CA1區(qū)神經(jīng)元大量脫失；與致癇組相比，干預(yù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元脫失不明顯，神經(jīng)元數(shù)量明顯增多。
　　 3.免疫組織化學(xué)染色：模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū)CX32表達(dá)較同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)CX32表達(dá)較同一時(shí)間點(diǎn)模型組降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義；CX43在致癇組表達(dá)是持續(xù)增高，隨著時(shí)程延長(zhǎng)陽性細(xì)胞表達(dá)增多，與對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)比較(24h、3d、7d、30d、P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)CX43表達(dá)較同一時(shí)間點(diǎn)模型組降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.CX32和CX43在癲樣放電后表達(dá)顯著增多，提示CX32、CX43在癲癇的發(fā)生發(fā)展過程中可能具有重要的意義。
　　 2.縫隙連接阻斷劑甘珀酸可能