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文檔簡介
1、Tet-Off/Tet-On系統(tǒng)是一種利用原核調(diào)控元件在真核細(xì)胞中定量并特異地控制外源基因表達(dá)的體系,它是用大腸桿菌Tn10轉(zhuǎn)座子中四環(huán)素操縱子原理來實施調(diào)控的。Tet-Off/Tet-On系統(tǒng)是比較成熟的真核生物外源基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)之一,具有高效、無毒、開/關(guān)較嚴(yán)密等特點,已被成功地應(yīng)用于細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠基因誘導(dǎo)表達(dá)的研究。c-myc是一種原癌基因,它是禽類骨髓瘤病毒v-myc的細(xì)胞同源序列,其編碼的蛋白是核內(nèi)特異性DNA結(jié)合蛋白。c
2、-myc加速了G1-S細(xì)胞周期進(jìn)程,從而促進(jìn)細(xì)胞增殖,形成腫瘤;還刺激細(xì)胞凋亡,c-myc是一個β細(xì)胞凋亡和嚙齒類動物體內(nèi)胰島分泌減少的強有力的引發(fā)者。 本研究首先應(yīng)用RT-PCR技術(shù),從人的宮頸癌細(xì)胞中成功擴(kuò)增出預(yù)期大小為1.32Kb的c-myccDNA的特異性條帶。將擴(kuò)增產(chǎn)物提純后克隆入pTZ57R/T載體,經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選及酶切鑒定后,獲得了該基因的克隆pTZ57R/T-c-myc。測序后將c-myc基因亞克隆入Tet-On系
3、統(tǒng)的pTRE2載體中,獲得pTRE2-c-myc重組載體。為了便于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選,我們將pCEP4上的Hyg酶切補平后克隆到同樣酶切補平的pTRE2-c-myc載體,獲得pTRE2-c-myc-Hyg。用pTet-On質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,通過G418篩選獲得表達(dá)Tet-On系統(tǒng)調(diào)節(jié)元件rtTA的陽性細(xì)胞CHO-pTet-On,經(jīng)過有限稀釋法獲得16個轉(zhuǎn)pTet-On基因的細(xì)胞單克隆。RT-PCR檢測rtTA的表達(dá)后,將pTRE2-c-
4、myc-Hyg基因轉(zhuǎn)染能穩(wěn)定表達(dá)rtTA的單克隆細(xì)胞,潮霉素篩選獲得能誘導(dǎo)表達(dá)c-myc基因的CHO-pTet-On-pTRE2-c-myc-Hyg細(xì)胞,通過細(xì)胞亞克隆后得到轉(zhuǎn)pTet-On-pTRE2-c-myc-Hyg基因細(xì)胞的單克隆15個。強力霉素(DOX)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞后,RT-PCR、間接免疫熒光檢測到c-myc的表達(dá)。WesternBlot檢測到c-myc基因的表達(dá)與誘導(dǎo)物濃度有一定的效量關(guān)系。這些結(jié)果表明我們建立的四環(huán)素誘
5、導(dǎo)表達(dá)體系是有效的,可以用于c-myc基因體外的研究。在正常的培養(yǎng)條件下,通過對轉(zhuǎn)pTet-On-pTRE2-c-myc-Hyg基因細(xì)胞生長測定,表明c-myc誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞生長增殖快,并在測定72h,差異顯著,表明c-myc促進(jìn)細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期測定表明c-myc基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞由G1向S期過渡,從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。但在低血清的條件下,轉(zhuǎn)pTet-On-pTRE2-c-myc-Hyg基因細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀和TUNEL檢測到凋亡,表明
6、c-myc促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 在體外細(xì)胞上驗證Tet-On誘導(dǎo)c-myc基因表達(dá)系統(tǒng)可靠性的基礎(chǔ)上,我們利用pBC胰腺高表達(dá)啟動子的載體,構(gòu)建含有Tet-On系統(tǒng)調(diào)節(jié)元件中的rtTA的重組載體pBC-rtTA。通過高保真酶PCR擴(kuò)增pTet-On上的rtTA基因,酶切rtTA,同時線形化pBC-SV40Tag載體(切去SV40Tag),將rtTA克隆到pBC上獲得重組載體pBC-rtTA。將pBC-rtTA和pTRE2-c-myc經(jīng)
7、酶切線性化、純化后,顯微注射混合的雙基因到小鼠受精卵雄原核中。共注射603枚卵,將注射后存活263枚卵移植到21只受體母鼠的輸卵管中,17只母鼠懷孕,共產(chǎn)仔59只。PCR檢測得到3只founder轉(zhuǎn)基因鼠,其中轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc基因陽性的公鼠2只(編號為6#和14#),同時獲得轉(zhuǎn)pTRE2-c-myc單基因陽性公鼠1只(編號為32#)。SouthernBlot檢測證實了PCR檢測的結(jié)果。3只founder小鼠與正
8、常FVB配種,仔代經(jīng)PCR檢測,統(tǒng)計結(jié)果符合孟德爾遺傳定律,證明外源基因穩(wěn)定遺傳給后代。轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc雙基因陽性小鼠仔代經(jīng)DOX誘導(dǎo)后,RT-PCR檢測到1只founder的后代在其腦、心、肝、脾、腎、胃、腸、胰腺、生殖器部位表達(dá)c-myc基因。另1只founder的后代檢測不到c-myc基因的表達(dá)。我們獲得能誘導(dǎo)表達(dá)c-myc的轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc基因小鼠。 將轉(zhuǎn)pBC-rtT
9、A、pTRE2-c-myc基因陽性且能表達(dá)c-myc的轉(zhuǎn)基因小鼠擴(kuò)大繁殖。通過對轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc基因小鼠形態(tài)、行為的觀察,和對轉(zhuǎn)基因小鼠生長發(fā)育、繁殖指標(biāo)、血液生理生化等指標(biāo)測定和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗以及組織切片的病理分析,結(jié)果表明轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc基因小鼠經(jīng)DOX誘導(dǎo)后,與正常的小鼠以及未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)雙基因小鼠相比,其形態(tài)和行為,肉眼觀察未見異常;生長發(fā)育方面:體重要顯著低于正常的FVB小鼠和
10、出生后未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠;同時在腸道長度的比較方面得到DOX誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠的大腸和小腸的長度略低于正常小鼠和轉(zhuǎn)基因未誘導(dǎo)的小鼠;其它臟器和繁殖指標(biāo)測定結(jié)果差異不顯著;淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗顯示DOX誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc基因小鼠指標(biāo)高于正常小鼠和不誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠但差異不顯著;血液生物化學(xué)指標(biāo)和血液生理指標(biāo)差異也不顯著;組織切片病理分析,轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)后與正常小鼠和未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠相比腎出現(xiàn)病變,腎小管上皮細(xì)胞腫脹、
11、腎小管腔狹窄,腎小球腎炎。 我們用胰腺高表達(dá)的啟動子啟動rtTA表達(dá),再用其調(diào)控c-myc在轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá),經(jīng)過一段時間的誘導(dǎo),RT-PCR在胰腺、腎、脾、肝等臟器上檢測到了c-myc基因的表達(dá),出現(xiàn)生長發(fā)育較慢??赡苡捎赾-myc促細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的影響??紤]到c-myc雙向功能,我們用另一個促細(xì)胞增殖的因子刺激c-myc以使其發(fā)揮促細(xì)胞增殖的作用,來建立腫瘤模型。本實驗室已建立了pTet-On、pTRE2-SV40Tag轉(zhuǎn)基
12、因小鼠。SimianVirus40(SV40)屬于多瘤病毒屬,SV40Tag具有致瘤性。我們利用制作的轉(zhuǎn)pTRE2-c-myc單基因陽性小鼠與pTet-On、pTRE2-SV40Tag轉(zhuǎn)基因小鼠配種,獲得轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-c-myc、pTRE2-SV40Tag基因小鼠。強力霉素持續(xù)給水誘導(dǎo)c-myc、SV40Tag表達(dá),肉眼觀察到轉(zhuǎn)基因小鼠頭上出現(xiàn)“帽狀”腫脹;再通過核磁共振,掃描到在小腦和大腦交界處出現(xiàn)腫瘤,腹部也掃描到腫
13、瘤;剖檢發(fā)現(xiàn)確實在大腦和小腦之間有腫瘤,腹部胰腺也有瘤。我們一共誘導(dǎo)了17只轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-c-myc、pTRE2-SV40Tag基因小鼠,有8只發(fā)瘤,發(fā)生率47%。誘導(dǎo)56-135d該轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)瘤。其中5只同時發(fā)胰腺瘤和腦瘤,2只單發(fā)腦瘤還有1只單發(fā)胰腺瘤(其編號分別為58、59、19、18、69、45、140、143#)。同時我們也誘導(dǎo)了84只轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-SV40Tag基因小鼠作為對照,只有3只發(fā)腦
14、瘤,發(fā)生率3.6%。 從誘導(dǎo)開始到發(fā)瘤時間為150-220d。在同期的小鼠誘導(dǎo)實驗中也用8只轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-c-myc、pTRE2-SV40Tag基因小鼠未誘導(dǎo)做對照,沒有腫瘤發(fā)生。未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-SV40Tag基因小鼠10只也沒發(fā)瘤。此實驗結(jié)果表明:誘導(dǎo)c-myc、SV40Tag表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠與誘導(dǎo)表達(dá)SV40Tag轉(zhuǎn)基因小鼠相比發(fā)瘤的幾率增大、發(fā)瘤的時間縮短、發(fā)瘤部位增多。結(jié)果提示c-m
15、yc和SV40Tag兩種基因的協(xié)同作用導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生部位增多、發(fā)生時間縮短、發(fā)生幾率增大,這也進(jìn)一步說明c-myc基因在一定程度上可以加快或直接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。 本研究通過RT-PCR檢測了c-myc和SV40Tag基因表達(dá)的部位、以及它們在腦和胰腺表達(dá)時間,表明:c-myc基因不僅在腦和胰腺表達(dá),在心、肝、脾、腎、胃、腸也表達(dá);而SV40Tag除了在腦和胰腺表達(dá)外,在胸腺、心、肝、腎、胃中也表達(dá)。c-myc基因在腦部的小腦、
16、腦干中表達(dá),而SV40Tag在腦部的皮層、小腦、腦干表達(dá)。c-myc和SV40Tag基因都是在DOX誘導(dǎo)第3d檢測到在腦和胰腺的表達(dá)。Real-timePCR結(jié)果顯示c-myc基因在腦腫瘤中表達(dá)量是誘導(dǎo)第3d表達(dá)量的64倍,c-myc基因在胰腺腫瘤中表達(dá)量是誘導(dǎo)第3d其在胰腺中表達(dá)量的74倍。SV40Tag基因在胰腺腫瘤中表達(dá)量是第3d胰腺中表達(dá)量的60倍。表明腫瘤發(fā)生與c-myc和SV40Tag高表達(dá)有直接的關(guān)系。 通過組織病
17、理學(xué)、細(xì)胞特異標(biāo)記分子的檢測等方法對轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-c-myc、pTRE2-SV40Tag三基因小鼠腦腫瘤和胰腺腫瘤的類型進(jìn)行初步鑒定。根據(jù)腦腫瘤病理切片的特征和Real-timePCR檢測到成神經(jīng)管細(xì)胞瘤起源的EGL祖細(xì)胞特異標(biāo)記分子math1在腦腫瘤中表達(dá)水平是正常小鼠表達(dá)水平的3倍;再結(jié)合膠質(zhì)細(xì)胞特異分子標(biāo)記GFAP、S100.β和神經(jīng)元的特異分子標(biāo)記NSE的免疫組織化學(xué)方法檢測陽性的結(jié)果,初步鑒定該腦腫瘤為小鼠成神
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