AD-PEDF對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞及人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞體外作用的研究.pdf

1、目的:本研究采用腺病毒載體介導(dǎo)的重組色素上皮源性因子(recombinant pigment epithelium-derived factor adenovirus, Ad-PEDF)在體外感染胃癌SGC7901細(xì)胞，并檢測(cè)PEDF在該細(xì)胞中的的表達(dá)、分泌情況以及對(duì)SGC7901細(xì)胞及臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管的影響，探討PEDF抗血管生成及對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的作用，探索胃癌基因治療的新方法。
　　方法:(1)將已構(gòu)建

2、好的攜帶PEDF基因的腺病毒(Ad-PEDF)及帶有綠色熒光蛋白基因的空載腺病毒(Ad-GFP)感染HEK293細(xì)胞，進(jìn)行病毒擴(kuò)增，收集病毒上清液。(2)擴(kuò)增后的病毒上清液分別通過(guò)RT-PCR反應(yīng)和Western Blotting，鑒定病毒中PEDF基因的mRNA和蛋白的表達(dá)情況，用TCID50法測(cè)定擴(kuò)增后的病毒滴度。(3)運(yùn)用擴(kuò)增后的Ad-PEDF及Ad-GFP病毒上清液以最佳感染復(fù)數(shù)感染體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞系SGC7901，同時(shí)以未加

3、腺病毒的胃癌細(xì)胞系SGC7901組為空白對(duì)照組，72h后收集各組細(xì)胞條件培養(yǎng)基，運(yùn)用Western Blotting鑒定各組細(xì)胞PEDF蛋白分泌表達(dá)情況。(4)體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞系SGC7901及臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，運(yùn)用CCK-8試劑盒檢測(cè)胃癌細(xì)胞系7901及臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，在不同條件下的增殖抑制率。(5)體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞系SGC7901及臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，運(yùn)用Transwell小室研究其在不同條件下的侵襲及遷移的體外生物學(xué)活性。(

4、6)體外培養(yǎng)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察在各組不同條件下血管生成形態(tài)，研究色素上皮衍生因子對(duì)體外血管內(nèi)皮細(xì)胞生物活性。本實(shí)驗(yàn)采用完全隨機(jī)單因素方差分析法（ANOVA法）對(duì)各組的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并采用q檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，檢驗(yàn)其差異性。
　　結(jié)果:(1)重組腺病毒載體感染HEK293細(xì)胞后在HEK293細(xì)胞中大量擴(kuò)增。(2)按設(shè)計(jì)的PEDF引物序列PCR擴(kuò)增Ad-PEDF可觀察到長(zhǎng)約1.25kb的PEDF基因片段。免疫印跡(W

5、estern Blotting)結(jié)果顯示感染HEK293細(xì)胞的Ad-PEDF組得到分子量約為50 kDa的免疫雜交條帶，而Ad-GFP及未感染腺病毒的HEK293組未見(jiàn)目的雜交條帶出現(xiàn)，經(jīng)TCID50法鑒定擴(kuò)增后的Ad-PEDF及Ad-GDF的病毒滴度較高，分別為6.3×107pfu/mL，Ad-GFP滴度約為6.3×108pfu/mL。(3)重組腺病毒感染胃癌細(xì)胞系SGC7901 Western Blotting分析結(jié)果顯示，Ad-P

6、EDF/胃癌7901可見(jiàn)PEDF目的蛋白的表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染胃癌7901，Ad-GFP/胃癌7901則未見(jiàn)表達(dá)。(4)運(yùn)用CCK8試劑盒分析重組PEDF對(duì)胃癌細(xì)胞及臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用，結(jié)果顯示，與陰性組和對(duì)照組相比，Ad-PEDF組對(duì)胃癌細(xì)胞系SGC7901的增殖影響無(wú)明顯差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，Ad-PEDF/胃癌SGC7901組OD值為0.35±0.01，與未感染胃癌SGC7901及A

7、d-GFP/胃癌SGC7901組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(5)胃癌細(xì)胞及臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ad-PEDF能明顯抑制胃癌細(xì)胞系SGC7901的侵襲、遷移，Ad-PEDF/胃癌細(xì)胞系SGC7901組阻止人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞侵襲及遷移，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(6)基質(zhì)膠上模擬體外血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果可觀察到，未轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901及Ad-GFP/胃癌SGC7901組形成大量的小管，Ad-P