基于基因表達(dá)譜芯片技術(shù)的金納米粒子分子生物相容性機(jī)理研究.pdf

1、納米生物材料具有許多優(yōu)良的理化特性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，為了使納米生物材料在生物系統(tǒng)中的應(yīng)用更加安全有效，建立納米材料安全性評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)體系，研究納米材料與細(xì)胞作用的機(jī)制越來越得到各界的重視。金納米粒子作為一種納米生物材料，在疾病診斷、藥物載體、腫瘤治療等許多生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。目前，關(guān)于金納米粒子的分子生物相容性的研究還很少。本論文的研究目的是在金納米粒子與細(xì)胞相互作用的檢測基礎(chǔ)上，采用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)

2、分析，對金納米粒子與人皮膚成纖維細(xì)胞（HumanDermalFibroblasts-fetal，HDF-f）的分子生物相容性機(jī)理進(jìn)行研究。通過探索研究納米材料與機(jī)體相互作用的機(jī)理的新途徑，為建立基于基因表達(dá)譜芯片技術(shù)的納米材料分子生物相容性評價(jià)的新方法打下基礎(chǔ)。本論文的具體工作如下：
　　 1）采用檸檬酸鈉還原氯金酸法制備20nm納米金溶膠并進(jìn)行表征?？疾?00μM，20nm納米金與HDF-f細(xì)胞作用1h、4h和8h后的情況。應(yīng)

3、用流式細(xì)胞術(shù)研究了納米金對細(xì)胞周期和凋亡的影響，結(jié)果表明納米金有促進(jìn)S期細(xì)胞增加而G2/M期細(xì)胞減少的趨勢。
　　 2）應(yīng)用Illumina基因組表達(dá)譜芯片獲得200μM，20nm納米金與HDF-f細(xì)胞作用1h、4h和8h后差異基因表達(dá)情況，按照Illumina表達(dá)譜芯片篩選原則，1h、4h和8h這3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的差異表達(dá)基因分別為1212個(gè)，384個(gè)和492個(gè)，共計(jì)不重復(fù)具有GeneID的基因1794個(gè)。應(yīng)用熒光定量RT-PCR

4、實(shí)驗(yàn)對4個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證基因的表達(dá)情況與基因表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)一致。
　　 3）應(yīng)用Cluster&TreeView軟件對200μM，20nm納米金作用HDF-f細(xì)胞1h、4h和8h后1794個(gè)基因進(jìn)行聚類分析，按照差異表達(dá)基因的表達(dá)模式分為6簇。應(yīng)用GoSurfer軟件和DAVID數(shù)據(jù)庫對6簇基因分別進(jìn)行基因本體論（GeneOntology，GO）功能分類分析，發(fā)現(xiàn)具有類似表達(dá)模式的基因所涉及的基因在功能上有一定的相關(guān)性。

5、應(yīng)用GoSurfer軟件對全部1794個(gè)差異表達(dá)基因按照生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分結(jié)構(gòu)層級進(jìn)行GO功能分類研究。結(jié)果表明納米金可能廣泛影響細(xì)胞的生物學(xué)過程，細(xì)胞的核酸結(jié)合水平，轉(zhuǎn)錄因子的活性可能會(huì)有所改變，細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)和相應(yīng)酶及受體活性、蛋白復(fù)合體和與DNA的復(fù)制有關(guān)的過程可能會(huì)受到影響。
　　 4）應(yīng)用GenMAPP軟件，對200μM，20nm納米金作用HDF-f細(xì)胞1h、4h和8h后的全部差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)途

6、徑進(jìn)行分析，在GenMAPP數(shù)據(jù)庫中找到的差異表達(dá)基因共有1740個(gè)，共得到包含差異表達(dá)基因的MAPPs90個(gè)，對其中25個(gè)MAPPs代表的生物學(xué)途徑進(jìn)行了詳細(xì)討論，包括17個(gè)在本課題小組前期基于蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)的金納米粒子分子生物相容性機(jī)理研究結(jié)果中篩選出的途徑，5個(gè)差異表達(dá)基因數(shù)目較多及所占途徑總基因數(shù)的比例較高的途徑以及3個(gè)與細(xì)胞周期有關(guān)的途徑。將差異表達(dá)基因在生物學(xué)途徑中所起到的作用與它們的表達(dá)模式和GO功能分類的分析結(jié)合起來，綜

7、合進(jìn)行分析。
　　 5）應(yīng)用IngenuityPathwayAnalysis（IPA）分析平臺(tái)對200μM，20nm納米金處理HDF-f細(xì)胞1h，4h和8h后發(fā)生差異表達(dá)的1794個(gè)基因進(jìn)行分析，得到基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。對打分值最高的前5個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行具體分析。
　　 6）綜合對差異表達(dá)基因的聚類、GO、生物學(xué)途徑和基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，對納米金與細(xì)胞相互作用的分子機(jī)理進(jìn)行總結(jié)，納米金與細(xì)胞作用的具體機(jī)制及其可能引起的主要生物

8、學(xué)效應(yīng)包括：納米金可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，引起細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)控狀態(tài)的改變，影響細(xì)胞的形態(tài)、粘附與遷移，納米金可能對mRNA加工、細(xì)胞周期、能量代謝、受體信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程產(chǎn)生影響。將本論文的研究結(jié)果與國內(nèi)外納米金生物相容性研究現(xiàn)狀相比較，本論文除了得到了一些其他研究小組已經(jīng)獲得的納米金與細(xì)胞相互作用關(guān)系可能的結(jié)論，還得到了一些其他研究小組未曾報(bào)道過的納米金可能產(chǎn)生的其它生物學(xué)效應(yīng)。將本論文的研究結(jié)果與本課題小組前期有關(guān)鎳離子

9、誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性機(jī)理研究結(jié)論相比較，發(fā)現(xiàn)不同的生物材料與細(xì)胞作用后，雖然產(chǎn)生主要的細(xì)胞效應(yīng)具有相似之處，但不同材料表現(xiàn)出不同的內(nèi)在作用機(jī)理和基因調(diào)控方式，結(jié)合基因表達(dá)譜芯片和生物信息學(xué)分析方法，可以為研究細(xì)胞與材料作用的分子機(jī)理提供一種具有特異性和有效性的研究手段。與本課題小組前期基于蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)的金納米粒子分子生物相容性機(jī)理研究中獲得的差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)相比，盡管差異表達(dá)基因和蛋白在數(shù)量上有較大差異，但是差異表達(dá)基因和蛋白質(zhì)所涉及的主