大鼠SGC神經(jīng)元細(xì)胞中PIP5K亞型與PIP2以及M電流調(diào)節(jié)關(guān)系的研究.pdf

1、1980年Brown和Admas首次在牛蛙頸上交感神經(jīng)節(jié)中發(fā)現(xiàn)了M電流，這是一種慢激活，非失活電壓依賴型外向鉀離子電流，由于其可被毒蕈堿受體激活后所抑制而得名。M電流在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，是調(diào)控神經(jīng)元興奮性主要機(jī)制。作為唯一在神經(jīng)元閾電位附近激活的鉀電流，其功能降低可以引起神經(jīng)元興奮性增高，誘發(fā)癲癇等疾病。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了眾多的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽均可以調(diào)節(jié)M電流。
　　 G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled-recep

2、tors，GPCRs)是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的受體中種類最多的一類，具有重要的生理病理學(xué)和藥理學(xué)意義。不同的GPCR通過(guò)和相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生多種生理效應(yīng)。所有G蛋白都由α、β、γ3個(gè)不同的亞單位組成，根據(jù)α亞單位可分為4個(gè)亞家族：Gs，Gi/o，Gq和G12。
　　 在對(duì)M電流調(diào)節(jié)機(jī)制的研究中，一個(gè)共同的發(fā)現(xiàn)就是許多Gq蛋白偶聯(lián)受體激活后可以引起M電流的抑制。Gq蛋白偶聯(lián)受體被其特異性激動(dòng)劑激活后，使G蛋白的Gαq亞基與Gβ

3、γ亞基解離，Gαq可以激活PLC，從而水解PIP2，PIP2水解可產(chǎn)生IP3和DAG，IP3通過(guò)激動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體，升高細(xì)胞內(nèi)鈣，DAG可激活PKC。通過(guò)多年研究，人們逐漸認(rèn)識(shí)到，細(xì)胞膜磷脂PIP2水解、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高可能在受體激活抑制M電流中起重要的作用。
　　 磷脂酰肌醇4，5二磷酸(phosphatidylinositol4，5-bisphosphate，PIP2)是一種重要的磷脂分子，調(diào)控眾多細(xì)胞過(guò)程。在哺乳

4、動(dòng)物細(xì)胞中，PIP2主要來(lái)源于磷脂酰肌醇-4-磷酸-5-激酶(Phosphatidylinositol4-phosphate5-kinase，PIP5K)使磷脂酰肌醇4磷酸(phosphatidylinositol4-phosphate，PI4P)肌醇環(huán)5位磷酸化這條通路。目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞PIP5K可以分為α、β和γ三個(gè)亞型。其中γ亞型已發(fā)現(xiàn)三種剪切異構(gòu)體，以所編碼的氨基酸數(shù)量分別命名為γ635、γ661和γ687。
　　

5、 本研究論文以上述轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為出發(fā)點(diǎn)，利用原代神經(jīng)元轉(zhuǎn)染、小RNA干擾、激光掃描共聚焦顯微鏡、蛋白質(zhì)免疫印記、免疫熒光、細(xì)胞內(nèi)鈣成像、電生理膜片鉗等技術(shù)手段，系統(tǒng)研究了以下幾方面內(nèi)容：(1)大鼠SCG神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法的建立；(2)大鼠SCG神經(jīng)元細(xì)胞中PIP5K各亞型的表達(dá)及亞型特異性PIP5K siRNA的干擾效率；(3)大鼠SCG神經(jīng)元細(xì)胞中PIP5K亞型與PIP2的分布和代謝關(guān)系；(4)大鼠SCG神經(jīng)元細(xì)胞中PIP5K亞型與鈣信號(hào)

6、的相關(guān)性；(5)大鼠SCG神經(jīng)元細(xì)胞中PIP5K亞型與M電流調(diào)節(jié)的關(guān)系。研究論文具體內(nèi)容如下：
　　 第一部分大鼠SCG神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法的建立
　　 目的：建立一種高效批量電轉(zhuǎn)染不同年齡SD大鼠SCG神經(jīng)元細(xì)胞的方案。
　　 方法：用Nucleofector電轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染7日、14日、40日齡SD大鼠的SCG神經(jīng)元細(xì)胞，然后分別在傳統(tǒng)及改良培養(yǎng)液中培養(yǎng)，24小時(shí)后用臺(tái)盼藍(lán)染色方法觀察計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)染后成活率；通過(guò)改

7、變質(zhì)粒DNA或小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)與轉(zhuǎn)染液比例，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后在共聚焦顯微鏡下觀察計(jì)算轉(zhuǎn)染效率或干擾效率。
　　 結(jié)果：
　　 (1)改良培養(yǎng)液可以使14日齡以上SD大鼠SCG神經(jīng)元轉(zhuǎn)染后成活率達(dá)到75％以上，明顯高于傳統(tǒng)培養(yǎng)液(P＜0.01)，且結(jié)果穩(wěn)定，細(xì)胞狀態(tài)良好，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求；
　　 (2)通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件顯著提高了DNA的轉(zhuǎn)染率及

8、siRNA的干擾率：當(dāng)DNA與轉(zhuǎn)染液比例為1:100(μg：μ1)時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率最高；當(dāng)siRNA與轉(zhuǎn)染液比例為2:100(μg：μ1)時(shí)干擾率最高。
　　 結(jié)論：
　　 (1)采用NucleofectorTM轉(zhuǎn)染儀系統(tǒng)，選用G-013轉(zhuǎn)染程序和RatNeuron Nucleofector Kit(貨號(hào)VPG-1003)，轉(zhuǎn)染SD大鼠SCG細(xì)胞效果較好。
　　 (2)使用改良培養(yǎng)液使14日齡以上大鼠轉(zhuǎn)染成活率顯著提

9、高。
　　 (3)實(shí)驗(yàn)確定了轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中質(zhì)粒和siRNA最佳濃度，為進(jìn)一步研究打下了基礎(chǔ)。
　　 第二部分大鼠SCG神經(jīng)元PIP5K亞型的鑒定及特異性siRNA干擾效率測(cè)定
　　 目的：觀察大鼠SCG神經(jīng)元中PIP5K各亞型的分布、表達(dá)情況；驗(yàn)證RNAi技術(shù)對(duì)PIP5K基因的特異性沉默的干擾效率。
　　 方法：利用RT-PCR、Western Blot和免疫熒光的方法對(duì)PIP5K的α、β和γ三個(gè)各亞型在SC

10、G細(xì)胞中的表達(dá)和分布進(jìn)行鑒定；利用原代神經(jīng)元轉(zhuǎn)染和小RNA干擾的方法對(duì)PIP5K基因進(jìn)行特異性沉默，利用WesternBlot方法驗(yàn)證干擾效率。
　　 結(jié)果：
　　 (1)用Western Blot和免疫熒光的方法在7日齡SD大鼠SCG中均未檢測(cè)出PIP5Kα、β和γ亞型的表達(dá)；用Western Blot、RT-PCR和免疫熒光的方法在14日齡SD大鼠SCG中檢測(cè)到PIP5Kα和γ亞型有表達(dá)，α亞型主要存在于細(xì)胞膜上，γ

11、亞型則在全細(xì)胞均有分布；用WesternBlot方法在14日齡、40日齡SD大鼠SCG中仍未檢測(cè)出PIP5Kβ亞型的表達(dá)，在14日齡、40日齡SD大鼠海馬組織中檢測(cè)到PIP5Kβ亞型的表達(dá)。
　　 (2)針對(duì)PIP5Kα和γ亞型的兩種siRNA分別轉(zhuǎn)染SCG細(xì)胞，PIP5Kα和γ兩種亞型表達(dá)受到明顯抑制，Western Blot結(jié)果和免疫熒光結(jié)果均證明PIP5Kα和γ亞型RNAi的干擾效率可達(dá)到50％以上。
　　 結(jié)論：

12、
　　 (1)在14日齡SD大鼠SCG中可以檢測(cè)出PIP5Kα和γ亞型表達(dá)，α亞型主要存在于細(xì)胞膜上，γ亞型則在全細(xì)胞均有分布。
　　 (2)特異性的siRNA轉(zhuǎn)染使PIP5Kα和γ兩種亞型的表達(dá)受到明顯抑制，為后續(xù)研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。
　　 第三部分大鼠SCG神經(jīng)元細(xì)胞中PIP5K亞型與PIP2的分布和代謝關(guān)系的研究
　　 目的：觀察SD大鼠SCG細(xì)胞中PIP5K亞型與PIP2分布和含量的關(guān)系，觀察M

13、受體激活水解的PIP2是否具有PIP5K亞型特異性。
　　 方法：利用原代神經(jīng)元轉(zhuǎn)染和小RNA干擾的技術(shù)，觀察沉默PIP5Kα、γ不同亞型對(duì)大鼠SCG細(xì)胞PIP2分布(通過(guò)觀察與PIP2特異結(jié)合的PLC-PH-GFP)、含量（通過(guò)觀察anti-PIP2免疫熒光）的影響，以及對(duì)激活G蛋白偶聯(lián)受體后水解的PIP2的影響。
　　 結(jié)果：
　　 (1)PIP5Kα亞型基因沉默，對(duì)細(xì)胞內(nèi)PIP2的分布和含量影響很大，膜上P

14、IP2富集現(xiàn)象消失；而PIP5Kγ亞型沉默對(duì)細(xì)胞PIP2分布影響較小，只影響細(xì)胞膜PIP2含量，且PIP2減少程度低于PIP5Kα亞型，細(xì)胞膜上仍有明顯的PIP2富集。
　　 (2)沉默PIP5Kα及PIP5Kγ亞型后細(xì)胞M受體激活水解PIP2作用被抑制。
　　 結(jié)論：
　　 (1)PIP5Kα亞型基因沉默使細(xì)胞膜及細(xì)胞漿中的PIP2均明顯減少，其中對(duì)細(xì)胞膜PIP2含量影響最大。
　　 (2)PIP5Kγ

15、亞型沉默只對(duì)細(xì)胞膜上的PIP2含量有較小影響，且PIP2減少程度低于PIP5Kα亞型，但明顯影響M受體激活后細(xì)胞膜上PIP2的水解。
　　 第四部分大鼠SCG神經(jīng)元細(xì)胞中PIP5K亞型與鈣信號(hào)相關(guān)性的研究
　　 目的：研究PIP5Kα亞型和γ亞型基因沉默對(duì)于SCG細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的影響。
　　 方法：利用SD大鼠SCG原代神經(jīng)元轉(zhuǎn)染和小RNA干擾的技術(shù)，分別沉默PIP5Kα亞型和γ亞型基因，通過(guò)鈣敏感熒光染料Fluo

16、-4/AM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣，激光共聚焦顯微鏡觀察給予緩激肽(BK)時(shí)SCG細(xì)胞內(nèi)鈣的變化。
　　 結(jié)果：
　　 (1)外液中給予BK時(shí)，在轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的SCG細(xì)胞中超過(guò)68％(34/50)細(xì)胞中可以明顯看到內(nèi)鈣水平的升高，轉(zhuǎn)染PIP5KαsiRNA的SCG細(xì)胞大約為42％(24/55)，而表達(dá)PIP5Kγ siRNA的SCG細(xì)胞中，只有10％的神經(jīng)元(5/51)有反應(yīng)。
　　 (2)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA、

17、PIP5Kα亞型siRNA、PIP5Kγ亞型siRNA組對(duì)BK有反應(yīng)的細(xì)胞，其內(nèi)鈣濃度與給藥前內(nèi)鈣濃度的比值分別為1.76，1.45，1.09，其中PIP5Kγ亞型siRNA組的內(nèi)鈣升高程度與陰性對(duì)照siRNA組(P＜0.01)及α亞型siRNA組(P＜0.05)的內(nèi)鈣升高程度相比均顯著降低。
　　 結(jié)論：大鼠SCG神經(jīng)元細(xì)胞中經(jīng)由PIP5Kγ亞型生成的PIP2的水解是BK受體激活后升高細(xì)胞內(nèi)鈣的信號(hào)通路。
　　 第五部

18、分大鼠SCG神經(jīng)元細(xì)胞中PIP5K亞型與M電流調(diào)節(jié)關(guān)系的研究
　　 目的：研究大鼠SCG細(xì)胞不同PIP5K亞型在M和BK受體激活后抑制M電流中的作用。
　　 方法：利用大鼠SCG原代神經(jīng)元轉(zhuǎn)染和小RNA干擾的技術(shù)，觀察分別沉默PIP5Kα和γ亞型基因后，對(duì)激活M和BK受體抑制M電流的影響。
　　 結(jié)果：
　　 (1)給予BK后陰性對(duì)照siRNA、siRNAα和siRNAγ三組SCG神經(jīng)元細(xì)胞M電流的抑制率

19、分別為79.94±7.67％、97.74±1.52％、57.26±8.03％，siRNAγ組M電流抑制率與陰性對(duì)照組相比顯著減少(P＜0.05)。
　　 (2)給予M受體激動(dòng)劑Oxo-M后，陰性對(duì)照siRNA、siRNAα和siRNAγ三組SCG神經(jīng)元細(xì)胞M電流的抑制率分別為：93.27±3.61％、95.81±4.00％、48.04±4.24％，siRNAγ組M電流抑制率與陰性對(duì)照組相比明顯減少(P＜0.05)。
　　

20、 結(jié)論：經(jīng)由PIP5Kγ亞型合成的PIP2在G蛋白偶聯(lián)受體激活導(dǎo)致的SCG細(xì)胞M電流的抑制中發(fā)揮重要作用。
　　 總結(jié)
　　 本研究從PIP2合成的關(guān)鍵酶PIP5K入手，對(duì)SD大鼠SCG神經(jīng)元細(xì)胞PIP5K不同亞型在細(xì)胞PIP2生成以及其水解后的下游信號(hào)結(jié)果如內(nèi)鈣釋放、M電流抑制等中的作用進(jìn)行了系列觀察。在成功建立了成年SD大鼠SCG神經(jīng)元細(xì)胞最佳轉(zhuǎn)染條件的基礎(chǔ)上，鑒定了SCG神經(jīng)元主要存在PIP5Kα和γ亞型。進(jìn)一步研

21、究發(fā)現(xiàn)PIP5Kγ亞型雖然只生成SCG細(xì)胞膜上少量PIP2，但經(jīng)其生成的PIP2在G蛋白偶聯(lián)受體激活所致的PIP2水解、細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和M電流抑制中發(fā)揮重要作用，而PIP5Kα亞型盡管對(duì)SCG細(xì)胞中PIP2含量貢獻(xiàn)較大，但在上述過(guò)程中卻發(fā)揮較小作用。
　　 神經(jīng)元細(xì)胞中PIP5K存在多種亞型，通過(guò)生成PIP2而發(fā)揮重要的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)作用。認(rèn)識(shí)其亞型特異性特征和在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的意義，對(duì)于了解細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在離子通道功能調(diào)節(jié)中的作用及