尤文肉瘤融合基因介導(dǎo)的白喉毒素表達(dá)載體構(gòu)建及其作用研究.pdf

1、目的 研究證實(shí),95﹪的尤文腫瘤家族具有特異性t染色體易位,形成的EWS-FLI-1融合蛋白可以識(shí)別、結(jié)合一段特異基因序列(ACCGGAAGT)并且激活其下游基因表達(dá).該研究通過(guò)定向克隆,構(gòu)建了含有該特異序列和白喉毒素A鏈(DTA)基因的真核表達(dá)載體.轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的尤文肉瘤細(xì)胞后,檢測(cè)DTA表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞的殺傷作用,為腫瘤特異性基因治療探索新的方法.方法 1、用脂質(zhì)體法,把含有EWS-FLI-1特異結(jié)合基因序列的蟲熒光毒酶報(bào)告質(zhì)粒(pS

2、2)轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的尤文肉瘤細(xì)胞系(RD-ES、SK-ES)以及對(duì)照細(xì)胞系(Hela、NIH3T3).通過(guò)熒光分光光度計(jì)檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度,比較蟲光素酶的表達(dá).2、用定向克隆的方法,把DTA片段在NcoI和XbaI位點(diǎn)替換pS2中的蟲熒光素酶基因.構(gòu)建新載體pS2-DTA.雙酶切以及測(cè)序驗(yàn)證.3、共轉(zhuǎn)染p32和pS2-DTA,檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度,驗(yàn)證pS2-DTA轉(zhuǎn)染成功,并且對(duì)蟲熒光素酶合成產(chǎn)生抑制作用.4、轉(zhuǎn)染pS2-DTA后,通過(guò)RT