肝臟SR-BⅠ表達(dá)與SR-AⅠ-Ⅱ基因缺失小鼠脂質(zhì)代謝關(guān)系的初步研究.pdf

1、A類Ⅰ型和Ⅱ型清道夫受體(scavenger receptor class A types Ⅰ andⅡ，SR-A Ⅰ/Ⅱ)主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，它是巨噬細(xì)胞清道夫受體家族成員之一。SR-AⅠ/Ⅱ不僅介導(dǎo)脂質(zhì)內(nèi)吞，還在宿主防御、吞噬凋亡細(xì)胞和促進(jìn)細(xì)胞粘附等方面發(fā)揮著重要作用。人們以往對(duì)SR-AⅠ/Ⅱ的研究主要集中在其與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)關(guān)系的研究。研究發(fā)現(xiàn)，SR-A Ⅰ/Ⅱ可以促

2、進(jìn)動(dòng)脈壁損傷處的單核細(xì)胞粘附、巨噬細(xì)胞活化；SR-A Ⅰ/Ⅱ還可以與氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OxLDL)結(jié)合，促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)大量膽固醇的沉積和泡沫細(xì)胞形成。而泡沫細(xì)胞形成是AS的早期病理特征之一，因此認(rèn)為SR-AⅠ/Ⅱ與AS的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切。 AS是心血管疾病的常見類型，近年來其發(fā)病率逐漸升高，嚴(yán)重地威脅著人類的健康。血脂異常是AS發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素。眾多的資料顯

3、示血中膽固醇水平升高，AS發(fā)病的危險(xiǎn)性明顯增加，兩者間呈正相關(guān)關(guān)系。同時(shí)許多流行病學(xué)調(diào)查表明降低血總膽固醇(total cholesterol，TC)和低密度脂蛋白膽固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平，可以減少AS的危險(xiǎn)性。血甘油三酯(triglycerides，TG)水平的升高也會(huì)使AS發(fā)病的危險(xiǎn)性增加。與TG、TC、LDL不同的是，高密度脂蛋白膽固醇(high density

4、 lipoprotein cholesterol，HDL-C)被認(rèn)為是“好的膽固醇”，它在阻止AS的發(fā)生上具有重要作用；HDL可將周圍組織細(xì)胞中多余的膽固醇直接或間接地轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟降解，從而減少膽固醇在動(dòng)脈壁上的沉積。這一過程又被稱為膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport，RCT)。此外，HDL還具有對(duì)抗LDL氧化形成OxLDL的作用，從而減少其對(duì)血管內(nèi)皮的損傷。血脂水平受控于很多環(huán)節(jié)，其中肝臟的清道

5、夫受體，包括B類I型清道夫受體(scavenger receptor class B type I)及CD36對(duì)血脂的變化均有影響。 雖然，以往的研究認(rèn)為SR-AⅠ/Ⅱ在AS的發(fā)病過程中起著非常重要的作用，但它對(duì)機(jī)體脂質(zhì)代謝的影響如何，目前還不清楚而且報(bào)道很少。有研究認(rèn)為，SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠脂質(zhì)代謝紊亂而且體重增加，在高脂飲食的情況下，脂質(zhì)代謝紊亂和體重增加更加顯著。另外在對(duì)SR-AⅠ/Ⅱ高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中也發(fā)現(xiàn)

6、，其血清TG水平顯著升高，膽固醇濃度明顯下降；說明SR-AⅠ/Ⅱ可以顯著影響脂質(zhì)代謝。 為了進(jìn)一步探討SR-AⅠ/Ⅱ基因缺失對(duì)小鼠脂質(zhì)代謝的影響及其可能的作用機(jī)制，本研究以SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠和野生型對(duì)照小鼠為對(duì)象，觀察SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除后，脂質(zhì)代謝(包括血脂水平和肝臟脂質(zhì)水平)的變化，同時(shí)進(jìn)一步檢測(cè)肝臟清道夫受體SR-BI和CD36的表達(dá)。從SR-BI及CD36表達(dá)的角度探討SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除后小鼠脂質(zhì)代謝變化的

7、可能機(jī)制，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)SR-AⅠ/Ⅱ的生理功能提供理論依據(jù)。 研究目的 通過觀察SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠脂質(zhì)代謝的變化，同時(shí)檢測(cè)肝臟清道夫受體SR-BI和CD36基因表達(dá)水平，以探討SR-AⅠ/Ⅱ基因缺失對(duì)小鼠脂質(zhì)代謝的影響及其可能的作用機(jī)制。 研究方法 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除(KO)雄性小鼠和野生型(WT)雄性小鼠各96只，清潔級(jí)，4-5周齡，平均體重19.47±1.29g，由日本東

8、京大學(xué)Kodama教授惠贈(zèng)。各組小鼠均在層流架中飼養(yǎng)，先以AIN-93G基礎(chǔ)飼料喂飼一周以適應(yīng)環(huán)境。然后按實(shí)驗(yàn)要求隨機(jī)分為4組：SR-A Ⅰ/Ⅱ基因敲除小鼠普通飼料組(KO+CHOW)、SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠高脂飼料組(KO+HFD)、野生型小鼠普通飼料組(WT+CHOW)及野生型小鼠高脂飼料組(WT+HFD)。每組48只。連續(xù)喂養(yǎng)12周，喂養(yǎng)期間小鼠自由飲水?dāng)z食，每周稱量體重一次，并記錄各組小鼠攝食量。期間第0、3、6、12周每組

9、分別隨機(jī)抽取12只小鼠經(jīng)眼眶靜脈采血后處死，分離血清和肝臟用于指標(biāo)測(cè)定。 2、檢測(cè)指標(biāo)和方法2．1小鼠肝臟系數(shù)的計(jì)算：肝臟系數(shù)=[肝臟重量(g)/小鼠體重(g)]×1002.2 血脂水平測(cè)定：采用CHOD-PAP酶法檢測(cè)TC，用GPO-PAP酶法檢測(cè)TG，用直接法(酶法)檢測(cè)LDL-C和HDL-C。 2.3 肝臟膽固醇的抽提及測(cè)定：用硫磷鐵法檢測(cè)。 2.4．小鼠肝臟脂質(zhì)沉積觀察：肝臟冰凍切片，油紅O染色法，觀察視

10、野內(nèi)肝細(xì)胞脂滴大小和分布情況。 2.5 小鼠肝臟SR-BI和CD36mRNA表達(dá)：抽提肝臟總RNA；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．不同實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重變化經(jīng)過12周的喂養(yǎng)后，各組小鼠的體重隨喂養(yǎng)時(shí)間增加而增加。從第3周開始，SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠的體重均比飼以相同飼料的野生型小鼠增加。當(dāng)飼以普通飼料時(shí)，在3至6周各組間體重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；當(dāng)飼以高脂飼料時(shí)，在2至7周及12周各組

11、間體重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠或野生型小鼠，當(dāng)飼以普通飼料時(shí)體重均比飼以高脂飼料時(shí)增加，但二者`差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。飼以普通飼料時(shí)，基因敲除小鼠和野生小鼠體重在12周末分別比0周時(shí)增加了82.27﹪和80.38﹪，而在飼以高脂飼料時(shí)，則分別增加85.74﹪和74﹪。 2．不同實(shí)驗(yàn)組小鼠攝食量的變化從第1周開始至12周，SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠的日平均攝食量均比飼以同一種飼料的野生型小鼠

12、增加。當(dāng)飼以普通飼料時(shí)，在1、2，5至9周和11周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；當(dāng)飼以高脂飼料時(shí)，在1，2，5至7周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠或野生型小鼠，當(dāng)飼以普通飼料時(shí)日平均攝食量均比飼以高脂飼料時(shí)增加。當(dāng)SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠分別飼以普通飼料和高脂飼料時(shí)，其日平均攝食量的差異在1至3、5、6、8、9、11、12周有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；當(dāng)野生型小鼠分別飼以普通飼料和高脂飼料時(shí)，其日平

13、均攝食量的差異在1至7周有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3．不同實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟系數(shù)的變化飼以普通飼料或高脂飼料時(shí)，SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠和野生型小鼠之間肝臟系數(shù)無差異(P>0.05)。 4．不同實(shí)驗(yàn)組小鼠血脂水平的變化4．1不同實(shí)驗(yàn)組小鼠血清TG、TC、HDL的變化SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠飼以普通飼料或高脂飼料，在3、6、12周，其血清TG、TC、HDL均比野生型小鼠的下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但飼以

14、普通飼料和高脂飼料的SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠，兩者之間血清TG、TC、HDL無明顯差異(P>0.05)。飼以普通飼料和高脂飼料的野生型小鼠，兩者之間血清TG、TC、HDL也無明顯差異(P>0.05)。 4．2不同實(shí)驗(yàn)組小鼠血清LDL的變化SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠飼以普通飼料或高脂飼料，在3、6、12周，其血清LDL均比野生型小鼠的相應(yīng)值降低，尤其在第3周和第6周飼以高脂飼料時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但飼以普通飼料和

15、高脂飼料的SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠，兩者之間血清LDL無明顯差異(p>0.05)。飼以普通飼料和高脂飼料的野生型小鼠，兩者之間血清LDL也無明顯差異(P>0.05)。 5．不同實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的變化肝臟組織冰凍切片油紅O染色后，在高倍顯微鏡下觀察不同實(shí)驗(yàn)組小鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0周時(shí)SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠和野生型小鼠的肝細(xì)胞均無明顯可見脂滴；3周時(shí)SR-A Ⅰ/Ⅱ基因敲除小鼠的肝細(xì)胞可見分散、較小的脂滴，

16、6、12周肝細(xì)胞中脂滴增大、較密集，尤以高脂飼料為甚。但在3、6、12周，野生型小鼠肝細(xì)胞的脂滴的數(shù)量和體積均明顯小于SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠。 6．不同實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟膽固醇含量的變化SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠飼以普通飼料或高脂飼料，在3、6、12周，其肝臟膽固醇含量均比野生型小鼠的明顯升高，在12周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 7．不同實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟SR-BI mRNA表達(dá)的變化SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠飼以

17、普通飼料或高脂飼料，在3、6、12周，其肝臟SR-BI mRNA表達(dá)均比野生型小鼠明顯升高，6周及12周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而且從O至6周，SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠SR-BI mRNA表達(dá)呈明顯的逐漸升高的趨勢(shì)；但在野生型小鼠，未觀察到升高的趨勢(shì)。 8．不同實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟CD36 mRNA表達(dá)的變化飼以普通飼料或高脂飼料時(shí)，SR-AⅠ/Ⅱ基因敲除小鼠和野生型小鼠之間肝臟CD36 mRNA的表達(dá)無差異(P>0.0