人類乙型肝炎病毒e抗原結合蛋白2（HBEBP2）的克隆表達與部分功能研究.pdf

1、乙型肝炎病毒的感染不僅引起急慢性病毒性肝炎，而且與肝纖維化、肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，然而對于HBV感染目前尚無特效的治療技術和方法，這主要是由于HBV感染引起的病毒性肝炎發(fā)病機制還有諸多方面沒有研究清楚。近年來，隨著對HBV致病機制研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)在HBV致病機制中存在著其與肝細胞間復雜的相互作用關系。為此，本研究所篩選了肝細胞內能與e抗原相互結合的蛋白，并將其中一個未知功能新基因命名為乙型肝炎病毒e抗原結合蛋白2(HBEBP2

2、)。本研究即以此為基礎，通過以下研究內容，試圖闡釋該基因的生物學功能： 1．提取HepG2細胞總RNA，利用RT-PCR方法在HBEBP2基因的兩端分別引入BamHI和EcoR Ⅰ酶切位點，獲得目的基因片段，連接至pGEM-T載體，測序正確后插入至綠色熒光真核表達載體pEGFP-C1中，轉染HepG2細胞，24hr后在熒光倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞核出現(xiàn)明顯的綠色熒光信號，提示HBENP2主要定位于胞核內。 2．利用相同

3、方法將引入EcoR Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位點的HBEBP2基因片段插入至原核表達載體pET-32a(+)中，轉化BL21宿主菌，1mM/mlIPTG、37℃誘導4.5hr獲得了帶有組氨酸標簽的重組融合蛋白的優(yōu)化表達。隨后應用Western blot對表達蛋白的特異性進行了驗證。 3．將引入EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點的HBEBP2基因片段插入至酵母細胞表達載體pG-BKT7中，轉化AH109酵母菌株并獲得表達。再與含有肝細胞

4、文庫質粒的Y187酵母菌株配合，進行酵母雙雜交篩選獲得與HBEBP2相互結合的已知功能蛋白4種，包括人線粒體蛋白基因、人α-2-糖蛋白1、人甘露糖-p-長醇利用缺陷1基因和人絲氨酸蛋白酶抑制劑等蛋白基因。結果提示該蛋白可能與糖基化作用、脂類代謝、細胞增殖等密切相關。此外還篩選得到2個新基因，分別命名為HBEBP2結合蛋白B(HBEBP2BPB)(GenBank Aceession：DQ499598)和結合蛋白C(ItBEBP2BPC)(