BV2小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株GPR17基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及其功能鑒定.pdf

1、研究背景：
　　 小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)的免疫、炎癥相關(guān)細(xì)胞?！办o息態(tài)”小膠質(zhì)細(xì)胞缺乏吞噬功能，但在病理?xiàng)l件(如腦缺血后繼發(fā)性炎癥以及退行性腦變性疾病)時(shí)，則變形為阿米巴樣，可以吞噬死亡細(xì)胞，清除細(xì)胞殘骸，參與調(diào)節(jié)組織修復(fù)、放大炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元變性等，對(duì)包括嘌呤、嘧啶類似物、補(bǔ)體、細(xì)胞因子和趨化因子等物質(zhì)均有反應(yīng)。
　　 花生四烯酸經(jīng)5-脂氧酶(5-lipoxygenase)代謝產(chǎn)生半胱氨酰白三烯(cysteinylleuko

2、trienes，CysLTs，包括LTC4、LTD4和LTE4)是一類重要的炎癥介質(zhì)。腦缺血以及脊髓外傷后均有半胱氨酰白三烯類物質(zhì)釋放，通過(guò)激活其受體產(chǎn)生多種效應(yīng)。半胱氨酰白三烯受體有CysLT1和CysLT2受體兩種經(jīng)典的亞型。近來(lái)報(bào)道GPR17(Gprotein-coupledreceptor17)是一種尿嘧啶核苷酸/半胱氨酰白三烯雙重受體，能被尿嘧啶核苷酸類物質(zhì)(UDP，UDP-glucose和UDP-galactose)和Cys

3、LTs激活。目前，GPR17的研究較少，因此，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GPR17真核表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞株，可為研究其功能奠定基礎(chǔ)。
　　 GPR17在容易遭受缺血性損傷的器官(即腦、心和腎)呈高表達(dá)，在應(yīng)激或者病理?xiàng)l件下起重要的調(diào)節(jié)作用。正常腦內(nèi)，GPR17主要表達(dá)在神經(jīng)元以及少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞上，在星形膠質(zhì)細(xì)胞上沒(méi)有表達(dá)。大鼠局灶性腦缺血后，GPR17主要表達(dá)在激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，并且缺血中心區(qū)GPR17mRNA和蛋白的表達(dá)在12-24h和7

4、-14d呈現(xiàn)兩個(gè)高峰，在周邊區(qū)只在7-14d時(shí)有表達(dá)上調(diào)。
　　 小膠質(zhì)細(xì)胞除了表達(dá)GPR17和半胱氨酰白三烯受體之外，還表達(dá)其他核苷酸P2受體。GPR-17作為一種新型半胱氨酰白三烯/尿嘧啶核苷酸雙重受體，負(fù)調(diào)控CysLT1受體的作用已得到闡述，但在小膠質(zhì)細(xì)胞上有無(wú)這種作用還不明確，因此，需要在小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行研究。
　　 目的：
　　 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mGPR17的BV2細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上研究mGPR17激活后對(duì)B

5、V2細(xì)胞吞噬功能的影響。
　　 方法：
　　 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將pcDNA3.1-mGPR17轉(zhuǎn)到BV2細(xì)胞中，并用350μg/mlG418篩選得到陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株。RT-PCR、免疫熒光法以及Westernblotting方法檢測(cè)mGPR17表達(dá)，F(xiàn)luo-4測(cè)定激動(dòng)劑UDP或者LTD4處理后細(xì)胞內(nèi)鈣變化，免疫熒光計(jì)數(shù)法或者流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)給予CysLT1受體拮抗劑pranlukast或siRNA敲低GPR17后，

6、對(duì)激動(dòng)劑UDP、LTD4誘導(dǎo)BV2細(xì)胞吞噬功能的作用。
　　 結(jié)果：
　　 RT-PCR、免疫熒光法以及Westernblotting結(jié)果表明，重組的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-mGPR17在BV2細(xì)胞獲得表達(dá)。加入外源性激動(dòng)劑UDP或LTD4后，3種BV2細(xì)胞(BV2-WT細(xì)胞、BV2-pcDNA3.1細(xì)胞、BV2-mGPR17細(xì)胞)的熒光強(qiáng)度比值F/F0(F代表給予激動(dòng)劑之后120s內(nèi)的最大熒光強(qiáng)度值，F(xiàn)0代

7、表給予激動(dòng)劑之前各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均熒光強(qiáng)度值)沒(méi)有顯著性差異，但是，UDP誘導(dǎo)BV2-mGPR17細(xì)胞的反應(yīng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，曲線下面積顯著增加，BV2-pcDNA3.1細(xì)胞的反應(yīng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少；而LTD4誘導(dǎo)BV2-mGPR17細(xì)胞的反應(yīng)性細(xì)胞數(shù)減少，曲線下面積顯著減少。BV2-mGPR17細(xì)胞表達(dá)的CysLT1受體顯著下調(diào)。BV2-mGPR17細(xì)胞的自發(fā)吞噬能力減弱，UDP或者LTD4誘導(dǎo)BV2-mGPR17細(xì)胞的吞噬能力減弱。