人CD160基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建及其單克隆抗體的研制.pdf

1、CD160分子是糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，是免疫超家族成員，與其特異性配體HVEM分子結(jié)合所提供的共刺激信號(hào)在T細(xì)胞的增殖，活化，細(xì)胞因子產(chǎn)生和B細(xì)胞增殖，活化，分泌抗體產(chǎn)生等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。CD160分子作為一個(gè)負(fù)向抑制信號(hào)，參與眾多免疫過程。建立L929/CD160基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和鼠抗人CD160單克隆抗體的研制能夠?yàn)檫M(jìn)一步開展對(duì)CD160在機(jī)體免疫應(yīng)答中的生物學(xué)效應(yīng)的研究以及與其他共刺激信號(hào)之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系提供工具，進(jìn)而

2、深入探討和分析臨床相關(guān)疾病診斷，以及有效治療提供了可靠手段。
　　第一部分人CD160基因克隆及其基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立
　　【目的】構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人CD160基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
　　【方法】通過RT-PCR獲得人CD160全長(zhǎng)cDNA，然后以cDNA進(jìn)行目的基因的大量擴(kuò)增，并將插入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pEGZ-Term。經(jīng)測(cè)序正確后，通過脂質(zhì)體法將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term/CD160和輔助病毒載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞2

3、93T，收集含有完整重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的293T細(xì)胞培養(yǎng)上清，用以感染L929細(xì)胞；采用Zeocin篩選，并通過流式細(xì)胞術(shù)與RT-PCR的方法反復(fù)鑒定，成功獲得具有Zeocin抗性且細(xì)胞膜表面能穩(wěn)定表達(dá)CD160分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞CD160/L929。
　　【結(jié)果】成功克隆人CD160全長(zhǎng)cDNA，并成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人CD160的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/CD160。
　　【結(jié)論】本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人CD160的基因轉(zhuǎn)染

4、細(xì)胞株，為研制鼠抗人CD160單克隆抗體和研究CD160生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分鼠抗人CD160單克隆抗體的研制
　　【目的】研制鼠抗人CD160單克隆抗體。
　　【方法】以穩(wěn)定表達(dá)人CD160的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/CD160為免疫原，免疫6~8周齡的BALB/c小鼠；采用經(jīng)典的B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，將免疫小鼠的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，并于HAT選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)；以L929/CD1

5、60作為陽性篩選細(xì)胞株，并以轉(zhuǎn)染pEGZ-Term空載體的L929/mock細(xì)胞株作為陰性對(duì)照，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選；對(duì)所得陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行多次克隆化培養(yǎng)，直至獲得持續(xù)穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD160單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；采用Westen blot和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)，對(duì)獲得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行生物特性方面的鑒定；采用間接免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)分析CD160在健康人PBMC中T細(xì)胞表面的表達(dá)。
　　【結(jié)果】獲得l株持續(xù)

6、穩(wěn)定分泌鼠抗人CD160單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為5A7。經(jīng)快速定性試紙分析鑒定，5A7的重鏈為IgG，輕鏈為κ鏈；采用本科室建立的腹水誘生方法制備單克隆抗體，腹水的收獲量平均為3ml/只，經(jīng)protein G親和柱分離純化?？贵w的抗原表位競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)表明，單克隆抗體5A7與商品化抗體識(shí)別的抗原表位不同。間接免疫熒光分析結(jié)果顯示：?jiǎn)慰?A7能夠特異性識(shí)別人CD160分子，并且能夠識(shí)別健康人PBMC中T細(xì)胞表面的CD160分子。