白三烯D4激活BV2小膠質細胞的作用.pdf

1、研究背景：
　　 半胱氨酰白三烯(cysteinylleukotrienes，CysLTs，包括LTC4、LTD4和LTE4)是5-脂氧酶-花生四烯酸代謝途徑來源的一類重要炎癥介質。CysLTs通過激活半胱氨酰白三烯受體(cysteinylleukotrienesreceptor，CysLT受體，包括兩種主要亞型CysLT1和CysLT2受體)參與調節(jié)體內諸多病理生理過程，如腦缺血、腦外傷等。
　　 以往研究發(fā)現(xiàn)：在整體

2、腦缺血損傷過程中，腦內半胱氨酰白三烯含量增高，半胱氨酰白三烯受體可介導缺血后神經元損傷；給予小鼠皮層注射白三烯D4，可誘導神經元損傷。然而，離體細胞實驗結果顯示，白三烯D4不能直接誘導原代培養(yǎng)神經元損傷。據(jù)以上整體與離體的實驗結果的不一致，我們推測：白三烯D4誘導神經元損傷的作用，可能是間接通過腦內的其他類型細胞，如腦內參與炎癥調節(jié)的主要細胞小膠質細胞介導。小膠質細胞在腦損傷，腦內炎癥時迅速激活，對于腦缺血后炎癥進程有重要影響。然而，C

3、ysLTs是否參與激活小膠質細胞及其激活小膠質細胞的機制，尚待闡明。
　　 研究目的：
　　 觀察白三烯D4激活小鼠BV2小膠質細胞的作用，并初步探討白三烯D4激活BV2細胞的作用機制。
　　 研究方法：
　　 1.以KLH偶聯(lián)的CysLT1受體多肽(小鼠)免疫家兔制備兔抗小鼠CysLT1受體多克隆抗體，用ELISA法測定抗體效價，以抗原阻斷法測定抗體敏感性及特異性；
　　 2.以RT-PCR、W

4、esternblotting檢測BV2細胞半胱氨酰白三烯受體CysLT1和CysLT2mRNA和蛋白的表達；以細胞免疫染色法觀察CysLT1、CysLT2的亞細胞定位；
　　 3.BV2細胞以不同濃度(0-100nM)白三烯D4(LTD4)作用24h，光鏡下觀察小膠質細胞形態(tài)變化；以CCK法檢測細胞活性變化以反映細胞增殖；以熒光微珠示蹤法檢測BV2細胞吞噬變化。
　　 4.以CysLT1受體選擇性拮抗劑Monteluka

5、st(1-1000nM)、CysLT2受體選擇性拮抗劑HAMI3379(10-10000nM)和CysLT1/CysLT2受體雙重拮抗劑BAYu9773(1-1000nM)在預處理30分鐘后再給予LTD4作用24h(期間拮抗劑全程給藥)，以熒光微珠追蹤法檢測細胞吞噬變化，以RT-PCR法檢測細胞炎癥因子TNF-α、IL-β和IL-6的mRNA表達水平變化。
　　 研究結果：
　　 1.成功制備了兔抗小鼠CysLT1受體多

6、克隆抗體，ELISA測定顯示，制備的家兔抗小鼠CysLT1受體抗體的效價大于1/32728，對CysLT1受體的特異性強，對CysLT2受體和GPR17基本無交叉反應；
　　 2.BV2細胞在mRNA和蛋白水平表達CysLT1、CysLT2；免疫染色顯示CysLT1、CysLT2受體主要表達在胞膜；
　　 3.LTD4作用24h，BV2細胞形態(tài)變化不明顯，BV2細胞活性無明顯變化。
　　 4.LTD4(100nM

7、)作用24h，能顯著提高BV2細胞的吞噬能力、上調IL-6的mRNA表達，但不誘導TNF-α、IL-1β的表達上調；
　　 5.CysLT1受體選擇性拮抗劑Montelukast(100nM)，CysLT2選擇性拮抗劑HAM13379(100,1000和10000nM)以及CysLT1/CysLT2受體雙重拮抗劑BAYu9773(100nM)預給藥30min后，再給予LTD4100nM作用24h，能進一步增強吞噬；BAYu977

8、3(1nM)能拮抗LTD4誘導的吞噬；
　　 6.CysLT1受體選擇性拮抗劑Montelukast(1nM)，CysLT1/CysLT2受體雙重拮抗劑BAYu9773(1nM和10nM)處理可減弱LTD4100nM誘導的IL-6mRNA表達上調，而不同濃度的CysLT2選擇性拮抗劑HAMI3379對此沒有影響。
　　 結論：
　　 LTD4可激活小鼠BV2小膠質細胞，表現(xiàn)為細胞吞噬能力增強和炎癥細胞因子IL-6