枸杞類胡蘿卜素裂解關(guān)鍵酶基因(LcCCD1、LcCCD4和LcNCED1)的克隆及表達(dá)研究.pdf

1、類胡蘿卜素裂解氧化酶（CCDs）能夠催化裂解類胡蘿卜素和/或脫輔基類胡蘿卜素，產(chǎn)生參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的脫輔基類胡蘿卜素。雖然已有研究對(duì)不同植物的CCDs進(jìn)行了分離鑒定，但其在果實(shí)發(fā)育及抗逆等方面的功能仍有待于進(jìn)一步研究。枸杞富含類胡蘿卜素，是研究植物類胡蘿卜素代謝的優(yōu)良材料，本研究以枸杞植物為材料，應(yīng)用3′-RACE技術(shù)首次分離獲得三個(gè)枸杞類胡蘿卜素裂解酶基因LcCCD1、LcCCD4和LcNCED1，并對(duì)其表達(dá)和功能進(jìn)行了研究。

2、　　將LcCCD1、LcCCD4轉(zhuǎn)化大腸桿菌，應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)LcCCD1和LcCCD4基因編碼酶的裂解活性進(jìn)行了分析，通過對(duì)菌體顏色變化、類胡蘿卜素含量、共轉(zhuǎn)化菌頂空揮發(fā)物的分析表明，LcCCD1蛋白可以有效的將β-胡蘿卜素和番茄紅素分別氧化裂解為β-紫羅酮和假紫羅酮，而LcCCD4只能裂解β-胡蘿卜素產(chǎn)生β-紫羅酮。
　　應(yīng)用Sq-RT-PCR技術(shù)，對(duì)LcCCD1、LcCCD4和LcNCED1基因在枸杞中的組織表達(dá)規(guī)律進(jìn)

3、行了分析。結(jié)果表明，在枸杞果實(shí)中，LcCCD1基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著果實(shí)的成熟逐漸提高，這種表達(dá)變化規(guī)律和果實(shí)類胡蘿卜素含量積累及β-紫羅酮含量的變化相一致，而LcCCD4基因表達(dá)量隨著果實(shí)的成熟逐漸下降，這些結(jié)果表明主要是 LcCCD1參與了枸杞果實(shí)β-紫羅酮等香味物質(zhì)的形成，而LcCCD4主要是對(duì)果實(shí)類胡蘿卜素積累起著調(diào)控作用。通過分析果實(shí)發(fā)育過程中LcNCED1基因的表達(dá)與乙烯釋放、ABA及可溶性糖的含量變化，表明LcNCED1基因可

4、能通過調(diào)控ABA的生物合成參與了枸杞果實(shí)的發(fā)育成熟。此外，本研究發(fā)現(xiàn)LcNCED1基因還參與了干旱和高鹽脅迫等逆境脅迫應(yīng)答。
　　通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)LcCCD1和LcNCED1基因轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)其功能進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，LcCCD1基因在一定程度上能夠提高轉(zhuǎn)基因煙草β-紫羅酮的含量；對(duì)過表達(dá)LcNCED1基因的煙草植株進(jìn)行脅迫處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草植株具有較高的ABA含量和抗氧化酶活性、較低的電解質(zhì)滲出率及活性氧積累，表