Nud C基因的克隆、表達(dá)及其蛋白在鼻咽癌細(xì)胞系中的作用.pdf

1、細(xì)胞核遷移(nuclearmigration)是一種細(xì)胞核向細(xì)胞中特定位點(diǎn)移動(dòng)的非隨機(jī)現(xiàn)象，對(duì)于生長(zhǎng)分裂以及發(fā)育等正常的細(xì)胞活動(dòng)都是至關(guān)重要的，并且普遍存在于從酵母到哺乳動(dòng)物的許多真核生物中。核遷移蛋白C(nucleardistributionC，NudC)在核遷移中起著重要作用。NudC與其家族成員(包括胞質(zhì)動(dòng)力蛋白，肌動(dòng)蛋白，LIS1和NudE)相互作用，和微管一起參與細(xì)胞增殖、神經(jīng)遷移和腦發(fā)育。 微管在多種細(xì)胞功能中起著關(guān)

2、鍵作用，以微管動(dòng)力蛋白為靶點(diǎn)，在有絲分裂過(guò)程中阻抑微管功能的抗腫瘤藥物，例如紫杉醇、秋水仙素、長(zhǎng)春花堿等在治療腫瘤方面已經(jīng)顯示出它的重要性，已被廣泛應(yīng)用并取得了較好的療效。但是受藥物自身性質(zhì)的影響，臨床使用中逐漸暴露出來(lái)一些亟待解決的問(wèn)題。例如，腫瘤細(xì)胞的耐藥性、較差的水溶性和毒副作用等。 在人類，己證明NUDC的表達(dá)是被高度調(diào)控的，它的表達(dá)水平與各種細(xì)胞類型、增殖狀態(tài)有關(guān)，不同分裂能力的細(xì)胞呈現(xiàn)出不同水平的NUDC表達(dá)。正在分

3、裂的細(xì)胞中可以觀察到NUDC強(qiáng)烈的免疫標(biāo)記，NudC的mRNA水平在細(xì)胞周期的G1中期增加，NudC的蛋白水平在細(xì)胞周期的G2/M期增加了2倍，在生長(zhǎng)速率高的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中NudC的表達(dá)水平也是升高的。這些研究顯示NUDC的水平與癌細(xì)胞的增殖過(guò)程有密切的關(guān)系。因此這使NUDC很可能成為檢測(cè)腫瘤發(fā)生的一項(xiàng)指標(biāo)。 頭頸部惡性腫瘤中，鼻咽癌在廣東地區(qū)的發(fā)病率為30-50/10萬(wàn)人口，俗稱“廣東癌”。目前鼻咽癌治療方法以放療、化療和手術(shù)

4、為主，但對(duì)晚期、復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者療效不理想。鼻咽癌是一種增殖失控的疾病，而細(xì)胞增殖是通過(guò)細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的，其中有絲分裂和胞質(zhì)分裂是細(xì)胞周期中的重要階段。由于NUDC是完成有絲分裂所必需的蛋白，因此我們?cè)O(shè)想尋找特異性的小分子抑制劑來(lái)阻滯NUDC表達(dá)，使分裂增殖旺盛的鼻咽癌細(xì)胞停滯在有絲分裂期，從而NUDC很可能具有抑制腫瘤的活性，并成為腫瘤治療的新靶標(biāo)。 因此，本論文首先使用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)NudC基因進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化

5、。使用PCR方法，以質(zhì)粒pB42AD-NudC為模板，擴(kuò)增人NudC全長(zhǎng)cDNA，限制性酶內(nèi)切酶BamHI、XhoI及T4連接酶將NudC基因克隆于pET-28b構(gòu)建重組表達(dá)載體，篩選陽(yáng)性克隆后，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后，在大腸桿菌中BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)重組NUDC蛋白，并利用蛋白N'端的6個(gè)氨基酸尾確立了一套穩(wěn)定、有效的重組蛋白NUDC的純化工藝。利用金屬親和層析和DEAE陰離子交換層析，對(duì)表達(dá)后以水溶性形式存在的重組蛋白NUD

6、C進(jìn)行純化。結(jié)果顯示：經(jīng)陽(yáng)性篩選及測(cè)序分析，NudC基因全長(zhǎng)cDNA成功克隆到質(zhì)粒pET-28b，pET-28b-NudC可在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達(dá)NUDC融合蛋白，并通過(guò)親和層析及過(guò)柱獲得高純度的NUDC蛋白。 將純化的NUDC蛋白多次多點(diǎn)免疫新西蘭白兔，制備抗NUDC蛋白多克隆抗體，通過(guò)瓊脂雙向擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)初步檢測(cè)其免疫原性，通過(guò)ELISA確定多克隆抗體免疫效價(jià)，SDS-PAGE檢測(cè)其純度，WesternBlot鑒

7、定抗體蛋白特性。試驗(yàn)結(jié)果表明成功制備和純化了抗NUDC蛋白多克隆抗體，多克隆抗體免疫效價(jià)達(dá)到1∶25600，SDS-PAGE檢測(cè)其純度達(dá)到90％。 本論文首次使用間接免疫熒光染色法檢測(cè)了NUDC在鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2、HNE-2中的亞細(xì)胞定位。以抗NUDC蛋白多克隆抗體作為一抗，以經(jīng)過(guò)FITC免疫熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體作為二抗，并使用DAPI熒光染料特異地標(biāo)記細(xì)胞核，將NUDC蛋白標(biāo)記為綠色熒光，細(xì)胞核標(biāo)記為藍(lán)色熒光。結(jié)果

8、發(fā)現(xiàn)NUDC蛋白在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)核區(qū)附近，細(xì)胞核也可見(jiàn)少量表達(dá)。而NUDC蛋白在作為對(duì)照的人成纖維細(xì)胞NIH-3T3中的表達(dá)量相對(duì)較少。 同時(shí)，以鼻咽癌細(xì)胞細(xì)胞系CNE-2、HNE-2作為研究對(duì)象，鼻咽非癌性組織作為對(duì)照，裂解分離細(xì)胞和組織蛋白后，通過(guò)SDS-PAGE蛋白電泳和WesternBlot方法，在蛋白水平檢測(cè)了NUDC蛋白在鼻咽癌細(xì)胞CNE-2、HNE-2和鼻咽非癌性組織中的表達(dá)情況。結(jié)果證明在鼻咽癌細(xì)

9、胞CNE-2、HNE-2均有NUDC蛋白表達(dá)，且其在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于鼻咽非癌性組織。 為了進(jìn)一步探索鼻咽癌新的治療方法，本論文還使用MTT方法初步探討了NUDC抗體對(duì)鼻咽癌細(xì)胞活性的影響。通過(guò)向培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞CNE-2、HNE-2中加入不同濃度的NUDC抗體溶液共培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察鼻咽癌細(xì)胞CNE-2、HNE-2的細(xì)胞活性。結(jié)果證明鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)活性隨著培養(yǎng)液中抗NUDC蛋白的抗體濃度增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且存在著

10、劑量-反應(yīng)關(guān)系。 綜上所述，本論文成功地克隆、表達(dá)和純化了NUDC蛋白，并成功制備其多克隆抗體，證明了NUDC蛋白在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)和分布情況，創(chuàng)新性地證明了NUDC蛋白在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，并且抗NUDC蛋白抗體可在體外明顯地抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-2、HNE-2的生長(zhǎng)。這為進(jìn)一步研究NudC在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的分子作用機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)，也為開發(fā)治療鼻咽癌的新型制劑打下了良好的工作基礎(chǔ)，這很有可能為鼻