核結(jié)合因子在成骨細(xì)胞中的表達(dá)及其促骨髓間質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究.pdf

1、核結(jié)合因子在成骨細(xì)胞中的表達(dá)及其促骨髓間質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究第一部分：核結(jié)合因子(Cbfa1)在不同細(xì)胞系中表達(dá)的比較。目的：觀察核結(jié)合因子(Cbfa1)在人成骨肉瘤MG63細(xì)胞、人成骨肉瘤Soas-2細(xì)胞、成人原代成骨細(xì)胞、小鼠骨髓間質(zhì)細(xì)胞MBA-1、小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3E1、小鼠破骨前細(xì)胞RW264.7和人軟骨前體細(xì)胞SW1353中的表達(dá)，明確Cbfa1及其亞型在骨骼系統(tǒng)不同細(xì)胞系中的表達(dá)狀態(tài)，及在代表不同成骨細(xì)胞發(fā)育階段細(xì)

2、胞系的中表達(dá)差異，探討Cbfa1及其亞型表達(dá)與成骨細(xì)胞發(fā)育階段之間的關(guān)系。 方法：從正常骨折病人骨組織中分離人成骨細(xì)胞。按細(xì)胞種系來(lái)源分兩組，分別用半定量RT-PCR觀察Cbfa1mRNA在小鼠來(lái)源(小鼠骨髓間質(zhì)細(xì)胞、成骨前細(xì)胞、破骨前體細(xì)胞)及在人類來(lái)源(人成骨肉瘤細(xì)胞、成人原代成骨細(xì)胞、人軟骨前體細(xì)胞)細(xì)胞中的表達(dá)。小鼠來(lái)源的細(xì)胞系還觀察Cbfa1兩種亞型Cbfa1/P56、Cbfa1/P57的表達(dá)。用Western-blo

3、t檢測(cè)各種細(xì)胞中Cbfa1蛋白的表達(dá)。用FITC+DAPI觀察Cbfa1蛋白在成人原代成骨細(xì)胞和小鼠骨髓間質(zhì)細(xì)胞MBA-1中表達(dá)的亞細(xì)胞定位。 結(jié)論：Cbfa1mRNA的表達(dá)可能與成骨細(xì)胞的分化階段有關(guān)，小鼠來(lái)源的細(xì)胞系中以Cbfa1/P57亞型為主。Cbfa1蛋白的表達(dá)定位于細(xì)胞核內(nèi)。 第二部分MC3T3E1細(xì)胞分化過(guò)程中核結(jié)合因子(Cbfa1)及各相關(guān)基因的表達(dá)目的：研究在小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3E1誘導(dǎo)成骨過(guò)程中，

4、總Cbfa1及Cbfa1兩種亞型Cbfa1/P56、Cbfa1/P57的表達(dá)隨成骨細(xì)胞成熟過(guò)程的表達(dá)變化，觀察堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原、骨鈣素、骨涎蛋白、骨橋素及與Cbfa1相關(guān)的兩種轉(zhuǎn)錄因子MSX2、OSX在成骨細(xì)胞成熟過(guò)程中的變化。 方法：MC3T3E1細(xì)胞在β-甘油磷酸鈉，抗壞血酸存在的情況下培養(yǎng)22天，在細(xì)胞培養(yǎng)的不同時(shí)間(0，4，10，14，18，22天)，用α-磷酸奈酚法測(cè)定堿性磷酸酶活性，半定量RT-PCR檢測(cè)總Cbf

5、a1mRNA及Cbfa1兩種亞型Cbfa1/P56、Cbfa1/P57mRNA和Ⅰ型膠原、骨鈣素、骨涎蛋白、骨橋素mRNA以及MSX2、OSXmRNA的表達(dá)；用Western-blot檢測(cè)MC3T3E1細(xì)胞成熟過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)Cbfa1蛋白的表達(dá)；VanGieSon苦味酸酸性復(fù)紅染色法染色細(xì)胞Ⅰ型膠原；茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成。 結(jié)論：在MC3T3E1細(xì)胞的分化過(guò)程中，培養(yǎng)的第10天以前為細(xì)胞增殖期，培養(yǎng)的第10天到第22天為

6、骨基質(zhì)形成并成熟礦化期。Cbfa1mRNA及Cbfa1蛋白的表達(dá)隨成骨細(xì)胞的分化逐漸增高，以Cbfa1/P57mRNA亞型為主。Ⅰ型膠原、骨鈣素、骨涎蛋白、骨橋素、OSX、MSX2mRNA隨成骨細(xì)胞分化表達(dá)逐漸增高。 第三部分核結(jié)合因子(Cbfa1)誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)細(xì)胞MBA-1凋亡目的：研究Cbfa1的兩種N末端亞型Cbfa1/P56、Cbfa1/P57對(duì)骨髓間質(zhì)細(xì)胞MBA-1凋亡的影響，探討Cbfa1介導(dǎo)MBA-1細(xì)胞凋亡的機(jī)制

7、。 方法：將帶有Cbfa1/P56、Cbfa1/P57全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒用脂質(zhì)體方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到人骨髓間質(zhì)細(xì)胞MBA-1細(xì)胞中，造成MBA-1細(xì)胞的Cbfa1高表達(dá)，72小時(shí)后用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡率的變化，DAPI+FITC染色觀察細(xì)胞核的變化，并抽提蛋白進(jìn)行Cbfa1及相關(guān)凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Cytochrome-C、Caspase-3、Caspase-9和TNF-a的免疫印跡檢測(cè)。 結(jié)論：Cbfa1兩個(gè)N末