抗人DR4多克隆抗體的制備及其誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是多種癌癥治療方法之一。在癌癥治療中腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的死亡受體已經(jīng)成為最具有潛力的治療靶位點(diǎn)之一。DR4(Death receptor4)是TNFR超家族成員之一,其分子中具有富含半胱氨酸的胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域(death domain,DD)。DR4的膜外區(qū)與其配體TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)特異性結(jié)合后可激活效應(yīng)分子天冬蛋白酶(cas

2、pase),引發(fā)凋亡信號(hào)途徑,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。抗人DR4單克隆抗體能夠有效殺死腫瘤細(xì)胞,并對(duì)正常細(xì)胞無細(xì)胞毒作用,因而成為抗腫瘤抗體藥物研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。但是單抗制備繁瑣且成本高,在臨床上尚難廣泛應(yīng)用。而多克隆抗體制備簡(jiǎn)單且價(jià)格便宜。因此我們制備了抗人DR4多克隆抗體,初步研究了人DR4多抗誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的效果。
　　 本文采用RT-PCR方法從HeLa細(xì)胞中成功克隆出人DR4胞外區(qū)域(eDR4),通過抗原表位分析選

3、擇胞外區(qū)域抗原特異性較高的部分序列,構(gòu)建重組克隆載體pMD-eDR4,測(cè)序鑒定正確后構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pGEX-DR4并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌中獲得表達(dá)。經(jīng)Western blot鑒定,證實(shí)pGEX-DR4所表達(dá)的是融合蛋白GST-DR4。然后采用親和層析法分離純化融合蛋白GST-DR4,再通過切膠、透析獲得高純度的融合蛋白GST-DR4。用GST-DR4作為免疫原免疫小鼠制備了抗人DR4多克隆抗體。經(jīng)過Western blot、E

4、LISA方法鑒定獲得了高特異性、效價(jià)達(dá)1:12800的抗人DR4多克隆抗體。用制備好的抗人DR4多克隆抗體分別處理HeLa細(xì)胞和人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC),發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞在形態(tài)上有明顯的變化,細(xì)胞皺縮趨于圓形,核碎裂,形成凋亡小體；而HASMC的形態(tài)無變化。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示DR4抗體處理后HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制,并且隨著濃度的降低抑制率逐漸減小,將DR4抗體和DR5抗體同時(shí)處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)二者具有協(xié)同作用,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的