p38MAPK信號(hào)分子與uPA在乳腺癌中表達(dá)的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:乳腺癌是婦女最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且常發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，因此與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)的因子成為當(dāng)前研究重點(diǎn)之一。至今許多研究結(jié)果表明uPA在多種腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，但迄今為止的研究對(duì)其表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制研究較少。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)家族的重要成員，最近，p38MAPK信號(hào)通路因以正性調(diào)節(jié)的方式參

2、與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程而倍受關(guān)注。為此，本研究檢測(cè)了p-p38及uPA在乳腺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步在體外研究p38MAPK通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞uPA蛋白表達(dá)的影響，為p38MAPK抑制劑應(yīng)用乳腺癌治療提供相應(yīng)的理論依據(jù)。 材料與方法:1.材料60例乳腺癌組織蠟塊取自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院病理科，為2001年～2003年手術(shù)切除標(biāo)本。依據(jù)WHO2003年所推薦的乳腺癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，60例均為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。人乳腺

3、癌細(xì)胞系MDA-MB-231及MCF-7由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室已存的細(xì)胞復(fù)蘇而得。 2.試劑DMEM及RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，第一抗體分別為鼠抗人p-p38單克隆抗體及兔抗人uPA多克隆抗體。p38MAPK特異性抑制劑SB203580購(gòu)自美國(guó)Calbiochem公司。 3.實(shí)驗(yàn)方法3.1免疫組織化學(xué)(S-P)法：采用鏈霉素抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶法(S-P法)。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性

4、片作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判定：每張切片在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞，著色強(qiáng)度分為無(wú)色為0分，淺黃色和黃色為1分，棕黃色為2分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為＜10％為0分，10-50％為1分，＞50％為2分，兩項(xiàng)得分相乘結(jié)果≥2記為陽(yáng)性。 3.2Western印跡法：收集細(xì)胞加入RIPAbuffer裂解液，超聲處理，高速低溫離心提取總蛋白，用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。12％SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印，封閉后加相應(yīng)一抗

5、、二抗及DAB顯色，觀察拍照，進(jìn)行灰度值測(cè)定。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，行χ2檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)分析，確定P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果:1.p-p38和uPA蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，p-p38蛋白主要位于乳腺癌細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒，陽(yáng)性率為56.7％(34/60)，uPA蛋白主要分布于乳腺癌細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒，陽(yáng)性率為60.0％(36/60)

6、。p-p38表達(dá)陽(yáng)性的34例乳腺癌中uPA表達(dá)陽(yáng)性者25例；p-p38表達(dá)陰性的26例乳腺癌中uPA表達(dá)陰性者15例。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，兩者之間表達(dá)存在正相關(guān)(r=0.316，P＜0.05)。 2.乳腺癌組織中p-p38、uPA蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 p-p38及uPA蛋白表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)(P＜0.05)，而與患者的年齡、腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)。 3.兩種轉(zhuǎn)移性不同的乳腺癌細(xì)

7、胞中p-p38及uPA蛋白表達(dá) Western印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，高轉(zhuǎn)移性的MDA-MB-231細(xì)胞中p-p38及uPA蛋白表達(dá)水平高于低轉(zhuǎn)移性的MCF-7細(xì)胞。 4.用SB203580阻斷p38MAPK信號(hào)通路后乳腺癌細(xì)胞uPA蛋白表達(dá)的變化 加人SB203580后，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞uPA蛋白表達(dá)水平下降，且表達(dá)水平隨著SB203580濃度升高而下降。 討論MAPK(mitogen-act

8、ivatedproteinkinase)，即絲裂原活化蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的絲/蘇氨酸蛋白激酶超家族，將細(xì)胞外信號(hào)傳至細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖的調(diào)節(jié)及惡性轉(zhuǎn)化，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。p38MAPK是MAPK家族的重要成員，多種炎癥因子和生長(zhǎng)因子及應(yīng)激反應(yīng)可使p38MAPK的酪氨酸和蘇氨酸雙磷酸化，從而激活p38MAPK，p38MAPK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、運(yùn)動(dòng)及侵襲表型，在細(xì)胞遷移、腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移方面具有重

9、要的調(diào)控功能。尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)是一種絲氨酸蛋白水解酶，能激活纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，對(duì)細(xì)胞遷移和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)的降解有重要作用。 對(duì)于uPA表達(dá)與信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)系目前研究較少。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號(hào)通路參與胃癌、肺癌、淋巴瘤及乳腺癌等細(xì)胞uPA的表達(dá)調(diào)控。本研究顯示，60例乳腺癌組織中p-p38及uPA表達(dá)與乳腺癌的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且高轉(zhuǎn)移性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中p-p

10、38、uPA蛋白表達(dá)水平高于低轉(zhuǎn)移性的MCF-7細(xì)胞，提示p-p38、uPA過(guò)表達(dá)可能與乳腺癌的惡性進(jìn)展及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。免疫組化結(jié)果分析顯示，乳腺癌組織中p-p38和uPA表達(dá)存在正相關(guān)，提示uPA蛋白表達(dá)可能受p38MAPK信號(hào)通路的調(diào)控。因此，我們又進(jìn)一步在體外研究了乳腺癌細(xì)胞中p38MAPK信號(hào)通路與uPA蛋白表達(dá)的關(guān)系。Western印跡顯示，SB203580以濃度依賴方式降低乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞uPA蛋白表達(dá)，證明乳

11、腺癌細(xì)胞uPA蛋白表達(dá)可能通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路來(lái)調(diào)控。 綜上所述，p38MAPK信號(hào)通路通過(guò)上調(diào)uPA的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌的惡性進(jìn)展及侵襲轉(zhuǎn)移，但其確切機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。目前以細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分子為靶點(diǎn)的MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制劑成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為p38MAPK信號(hào)通路作為乳腺癌治療的靶點(diǎn)提供相應(yīng)的理論依據(jù)。 結(jié)論:1.p-p38、uPA蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌